本发明专利技术提供了一种定标测定腺苷脱氨酶的方法、配用的试剂盒和其用途，本发明专利技术用腺苷脱氨酶脱脱氢酶法检测试剂盒确定腺苷脱氨酶标准品的活性，再应用Ｔｒｉｎｄｅｒ氏法以标准品的活性为参照，定量测定生物样本中腺苷脱氨酶的活性。本发明专利技术优点在于解决了Ｔｒｉｎｄｅｒ氏法的缺陷，提高了精确度，减少了仪器误差以及增强了腺苷脱氨酶正常参考范围数据的可比性且通过测定腺苷脱氨酶的活性用于判断急性肝损伤及残留病变、协助诊断慢性肝病和肝纤维的诊断、黄疸的鉴别、结核性胸腹水诊断、中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断以及伤寒引发的高热诊断等，适合在医院中进行推广使用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学检验测定
，具体涉及一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法及其配用的试剂盒和其用途。
技术介绍
现有技术中用Trinder氏法定量测定腺苷脱氨酶活性在临床化学检验上较为普遍，但是，Trinder氏法缺点在于没能使用一种公认的标准法测定的腺苷脱氨酶标准品，从而造成测试精确度下降、不同实验室应用不同生化分析仪引起的仪器误差，此外还是腺苷脱氨酶正常参考范围数据混乱、不可比拟性的主要原因。 腺苷脱氨酶脱氢酶法应用腺苷脱氨酶解腺嘌呤核苷酸生成次黄嘌呤核苷和氨，氨和a-酮戊二酸以及还原性辅酶在谷氨酸脱脱氢酶的作用下反应生成谷氨酸及辅酶，在340nm处检测NADH的消耗速率来测定腺苷脱氨酶活性通过制定氨标准曲线，可定量腺苷脱氨酶活性，腺苷脱氨酶活性定义为在腺苷脱氨酶脱氢酶法条件下37t:每分钟产生一个P mol氨所需腺苷脱氨酶的量，其原理反应方程式如下腺苷脱氨酶腺嘌呤核苷酸+水--^次黄嘌呤核苷+氨谷氨酸脱氢酶氨+ a —酮戊二酸+还原性辅酶I 二钠盐--^谷氨酸+辅酶 但是腺苷脱氨酶脱氢酶法可定量测定腺苷脱氨酶活性，但此法易受外源性氨的干扰，不适于临床生化检验。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，而提供一种在Trinder氏法中加入腺苷脱氨酶标准品，用腺苷脱氨酶脱氢酶法确定腺苷脱氨酶标准品的活性，再应用Trinder氏法以腺苷脱氨酶标准品的活性为参照，定量测定生物样本中腺苷脱氨酶活性，从而保证精确度高，测定速度快，且减少了仪器误差以及增强了腺苷脱氨酶正常参考范围数据的可比性的定标测定腺苷脱氨酶活性的方法。 本专利技术的另一个目的是提供用以实现定标测定腺苷脱氨酶活性的方法的配用的试剂盒。 本专利技术的第三个目的是用以实现定标测定腺苷脱氨酶活性的方法的配用的试剂盒的用途，以提供腺苷脱氨酶的活性测定用于急性肝损伤及残留病变的诊断以及协助慢性肝病及肝纤维化的诊断。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为一种定标测定腺苷脱氨酶活性的4方法，其特征是包括以下步骤 步骤一是确定腺苷脱氨酶标准品的活性； 步骤二是再通过腺苷脱氨酶、嘌呤核苷酸化酶、黄嘌呤氧化酶及过氧化物酶酶解生成醌化合物； 步骤三是以连续监测醌化合物在546nm处吸光度的上升速率结合标准品的活性为参照，定量测定生物样本中腺苷脱氨酶的活性。 采取的措施还包括 在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法中，所述的步骤一中具体操作为将腺苷脱氨酶样本与试剂RI同时加入，并孵育180秒，然后加入试剂RII，再孵育420秒加入试剂RIII，在340nm处定量测定吸光度，并用不同浓度氨代替底物腺苷，按上述方法在340nm处用测试仪定量测定吸光度，以此画出标准曲线，有腺苷脱氨酶标准品的吸光度从标准曲线上求出对应的氨浓度，并将其除以反应时间既得出腺苷脱氨酶标准品活性。 在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法中，所述的试剂RI包括0. 015mol/L的a-酮戊二酸、0. 30X 10—3mol/L的还原型辅酶I 二钠盐、1. 50X 10—3mol/L的腺嘌呤核苷二磷酸单钠盐以及0. 1Omol/L的且pH值为7. 20的磷酸缓冲液，所述的试剂RII为200U/ml的谷氨酸脱脱氢酶，所述的试剂RIII包括1. 20X 10—2mol/L的腺苷，2. 00X 10—5mol/L的乙二胺四乙酸二钠，其中所述的试剂RII和试剂RIII均用pH7. 20磷酸缓冲液配置。 在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法中，所述的腺苷脱氨酶样本为10iiL，试齐U I为200iiL，试剂II为20iiL，试齐U III为50 y L，腺苷脱氨酶样本与试剂I同时加入，在第180秒加入试剂II，在第420秒加入试剂III，且温度反应温度控制37°C。 在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法中，所述的波长的主波长为340nm，副波长为430nm。 在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法中，所述的步骤三中的计算按以下公式进行计算 测试时间段每分钟平均吸光度的变化(A A/min)，(△Aymin + AA2/min +...............AAt/min)△ A/min =-t A A/min代表测试时间第lmin吸光度变化率 A A2/min代表测试时间第2min吸光度变化率 ............................................. A At/min代表测试时间第tmin吸光度变化率 t为测试时间 样本腺苷脱氨酶活性=(A Ax/ A e) X Ec 其中AAX =样本A A/min AAC =标准品AA/min Ec =腺苷脱氨酶标准品的活性。 —种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法配用的试剂盒，所述的试剂盒由以下成分组成包括试剂Rl、试剂R2、腺苷脱氨酶标准品、腺苷脱氨酶异常血清以及700测试/盒，所述的试剂Rl包括80mol/L的甘氨酸缓冲液、2mol/L的N_乙基_N_ (2-羟基-3-磺丙基)-3-甲 基苯胺钠盐、0. 5KU/L的嘌呤核苷磷酸化酶、0. 8KU/L的黄嘌呤氧化酶以及0. 6KU/L的过氧 化物酶，所述的试剂R2包括10mol/L的腺嘌呤核苷、2mol/L的4-氨基安替比林以及50mo1/ L且pH值为4. 0的Tris-HCL缓冲液，所述的腺苷脱氨酶标准品为人源基因重组蛋白，腺苷 脱氨酶异常血清为人源基因重组蛋白和人血清。 在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法配用的试剂盒中，所述的试剂盒包 含试剂Rl为130ml，试剂R2为70ml，腺苷脱氨酶标准品2ml/1瓶，腺苷脱氨酶异常血清 lml/1瓶。 —种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法配用的试剂盒的用途，该测定用于判断急性 肝损伤及残留病变、协助诊断慢性肝病和肝纤维的诊断、黄疸的鉴别、结核性胸腹水诊断、 中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断以及伤寒引发的高热诊断。 在上述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法配用的试剂盒的用途中，所依据的原理反应方程式如下 腺苷脱氨酶腺嘌呤核苷酸+水--^次黄嘌呤核苷+氨嘌呤核苷磷酸化酶 次黄嘌呤核苷+磷酸盐--^次黄嘌呤+核糖-1-磷酸黄嘌呤氧化酶 次黄嘌呤+水+氧气--^过氧化氢+尿酸过氧化物酶过氧化氢+4-氨基安替比林+N-乙基-N- (2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐--^醌化合物+水。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于用腺苷脱氨酶脱氢酶法确定腺苷脱氨酶标准 品的活性，再应用Trinder氏法以腺苷脱氨酶标准品的活性为参照，定量测定生物样本中 腺苷脱氨酶活性，本专利技术解决了 Trinder氏法的缺陷，提高了测试精确度、减少了仪器误差 和增强了腺苷脱氨酶正常参考范围数据的可比性，也方便了通过测定腺苷脱氨酶的活性用 于判断急性肝损伤及残留病变、协助诊断慢性肝病和肝纤维的诊断、黄疸的鉴别、结核性胸 腹水诊断、中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断以及伤寒引发的高热诊断等，适合在医院中 进行推广使用。具体实施例方式以下是本专利技术的具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的描述，但本专利技术并 不限于这些实施例。 1、腺苷脱氨酶标准品和其活性的确定 (1)腺苷脱氨酶标准品活性0-150U/L人源基因重组腺苷脱氨酶 (2)腺本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是：包括以下步骤： 步骤一是确定腺苷脱氨酶标准品的活性； 步骤二是再通过腺苷脱氨酶、嘌呤核苷酸化酶、黄嘌呤氧化酶及过氧化物酶酶解生成醌化合物； 步骤三是以连续监测醌化合物在５４６ｎｍ处吸光度的上升速率结合标准品的活性为参照，定量测定生物样本中腺苷脱氨酶的活性。
【技术特征摘要】
一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是包括以下步骤步骤一是确定腺苷脱氨酶标准品的活性；步骤二是再通过腺苷脱氨酶、嘌呤核苷酸化酶、黄嘌呤氧化酶及过氧化物酶酶解生成醌化合物；步骤三是以连续监测醌化合物在546nm处吸光度的上升速率结合标准品的活性为参照，定量测定生物样本中腺苷脱氨酶的活性。2. 根据权利要求1所述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是所述的步 骤一中具体操作为将腺苷脱氨酶样本与试剂RI同时加入，并孵育180秒，然后加入试剂 RI I ，再孵育420秒加入试剂RI 11 ，在340nm处定量测定吸光度，并用不同浓度氨代替底物腺 苷，按上述方法在340nm处用测试仪定量测定吸光度，以此画出标准曲线，有腺苷脱氨酶标 准品的吸光度从标准曲线上求出对应的氨浓度，并将其除以反应时间既得出腺苷脱氨酶标 准品活性。3. 根据权利要求2所述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是所述 的试剂RI包括O. 015mol/L的a-酮戊二酸、0. 30X10—3mol/L的还原型辅酶I 二钠盐、 1. 50X 10—3mol/L的腺嘌呤核苷二磷酸单钠盐以及0. 1Omol/L的且pH值为7. 20的磷酸缓冲 液，所述的试剂RII为200U/ml的谷氨酸脱脱氢酶，所述的试剂RIII包括1. 20X 10—2mol/ L的腺苷，2. 00X10—5mol/L的乙二胺四乙酸二钠，其中所述的试剂RII和试剂RIII均用 pH7. 20磷酸缓冲液配置。4. 根据权利要求3所述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是所述的腺 苷脱氨酶样本为10 y L，试剂I为200 ii L，试剂II为20 ii L，试剂III为50 ii L，腺苷脱氨酶 样本与试剂I同时加入，在第180秒加入试剂II，在第420秒加入试剂III，且温度反应温 度控制37°C。5. 根据权利要求4所述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是所述的波 长的主波长为340nm，副波长为430nm。6. 根据权利要求5所述的一种定标测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征是所述的步 骤三中的计算按以下公式进行计算测试时间段每分钟平均吸光度的变化(AA/min)，<formu...
【专利技术属性】
技术研发人员：张闻，
申请(专利权)人：张闻，
类型：发明
国别省市：97[中国|宁波]
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