本发明专利技术提供了一种用酶比色反应测定β－羟丁酸的方法及其配用的试剂盒和其用途。在Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ缓冲液体系下血清β－羟丁酸与辅酶Ｉ在β－羟丁酸脱氢酶的催化下脱氢生成乙酰乙酸和还原型辅酶Ｉ，生成的还原型辅酶Ｉ和碘硝基四氮唑紫在黄递酶的催化下反应生成最高吸光率在５０５ｎｍ处的红色物质甲月替（ｆｏｒｍａｚａｎｅ），据此可在５０５ｎｍ波长处测定红色产物吸光度的变化来定量生物样本中β－羟丁酸的含量。本法可线性测定生物样本中β－羟丁酸浓度范围（０～４．５ｍｍｏｌ／Ｌ），该测定用于判断人体酮症酸中毒诊断，本发明专利技术所用试剂应用液体双试剂，测定β－羟丁酸所需样本量少，此外，测定时反应时间短，操作简单，适用于大量检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学检验测定
，具体涉及一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法及其配用的试剂盒和其用途。
技术介绍
目前血清|3 -羟丁酸的测定目前检测的方法是酶动力学法，在辅酶I (NAD+)存在的条件下，P-羟丁酸在P-羟丁酸脱氢酶的作用下生成乙酰乙酸、还原型辅酶I(NADH)及氢离子，反应生成的还原型辅酶I (NADH)在340nm吸光度的变化可以间接反映病人血清中的P-羟丁酸的浓度。其反应过程如下 e -羟丁酸脱氢酶e -羟丁酸+辅酶i--^乙酰乙酸+还原型辅酶i +氢离子 但是此方法易受外源性的干扰。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，而提供一种在酶动力学法反 应测定P-羟丁酸的基础上偶联了一步酶反应，从而保证精确度高及其配速度快、操作简 单的用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法。 本专利技术的另一个目的是提供用以实现用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法配用 的试剂盒。 本专利技术的第三个目的是一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法配用的试剂盒 的用途，用来判断人体酮症酸中毒程度。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为一种用酶比色反应测定P-羟丁 酸的方法，所采取的措施为P-羟丁酸与辅酶I在P-羟丁酸脱氢酶的催化下脱氢生成乙 酰乙酸和还原型辅酶I，生成的还原型辅酶I和碘硝基四氮唑紫在黄递酶的催化下反应生 成最高吸光率在505nm处的红色物质甲月替(formazane)，并在505nm波长处测定红色物质 甲月替(formazane)吸光度的变化来定量生物样本中P _羟丁酸的含量，其反应方程式如下 0 -羟丁酸脱氢酶e-羟丁酸+辅酶i---------^乙酰乙酸+还原型辅酶i+氢离子黄递酶还原型辅酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(formazane) +辅酶I。 采取的措施还包括 在上述的一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法中，上述的反应过程具体为在0. 225ml的试剂I中加入6 ii L的0 4. 5mmol/L的P -羟丁酸，并置于37。C水浴5分钟，并 读取吸光度AO，加入0. 075ml的试剂11，37水浴5分钟后，读取吸光度Al， AA = Al-AO。 在上述的一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法中，所述的试剂I包括 lOOmmol/L的Tris-HCL缓冲液、pH值为8. 5的20mmol/L的草酸、2. 5mmol/L的辅酶I、1KU/ L的黄递酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的试剂II包括1KU/L的P -羟丁酸脱氢 酶。 在上述的一种用酶比色反应测定13 -羟丁酸的方法中，其特征是13 -羟丁酸的含 量计算按以下公式进行计算 P -羟丁酸浓度(mmol/L) = ECX AAX/AAC ; 其中AX =样本吸光率A5。5 Ac =标准品吸光率A5。5Ec = P -羟丁酸标准品浓度(mmol/L)。 —种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法配用的试剂盒，所述的试剂盒由以下成 分组成包括试剂I，试剂II、 P-羟丁酸标准品、P-羟丁酸异常血清对照以及266测试/ 盒，所述的试剂I包括100mmol/L的Tris-HCL缓冲液、pH值为8. 5的20mmol/L的草酸、 2. 5mmol/L的辅酶I、1KU/L的黄递酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的试剂II包括 1KU/L的13 -羟丁酸脱氢酶，所述的试剂I为120ml ，试剂II为40ml 。 在上述的一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法配用的试剂盒中，所述的每个 试剂盒包含试剂I 一瓶60ml 、试剂II 一瓶20ml 、 P -羟丁酸标准品一瓶1ml 、 P -羟丁酸异 常血清对照一瓶1ml 。 —种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法配用的试剂盒的用途，该测定用于判断 人体酮症酸中毒诊断。 在上述的一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法配用的试剂盒的用途中，所依据的原理反应方程式如下 0 -羟丁酸脱氢酶e-羟丁酸+辅酶I---------^乙酰乙酸+还原型辅酶I +氢离子黄递酶还原型辅酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(formazane) +辅酶1。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于可线性测定生物样本中P-羟丁酸浓度范 围，并应用液体双试齐U，测定P _羟丁酸所需样本量少，仅需6 P L血清即可，此夕卜，测定时反 应时间短，操作简单，适用于大量检测，同时也方便通过测定血中P-羟丁酸的含量可作为 糖尿病患者病情变化的指标，为防止并发症的产生和酮症酸中毒形成提供了及时可靠的防 治依据。具体实施例方式以下是本专利技术的具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的描述，但本专利技术并 不限于这些实施例。 本专利技术酶比色法反应测定13 -羟丁酸是在酶动力学法反应测定13 -羟丁酸的基础上偶联了一步酶反应，反应过程当中，首先P-羟丁酸在P-羟丁酸脱氢酶的作用下生成乙 酰乙酸、还原型辅酶I及氢离子，生成的还原型辅酶I和碘硝基四氮唑紫在黄递酶的催化下 反应生成红色物质甲月替(formazane)在505nm处有最高吸光度，其反应方程式如下 e -羟丁酸脱氢酶e-羟丁酸+辅酶i---------^乙酰乙酸+还原型辅酶i+氢离子黄递酶还原型辅酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(formazane) +辅酶I 1.试剂组成试剂I包括100mmol/L的Tris-HCL缓冲液、pH值为8. 5的20mmol/L的草酸、 2. 5mmol/L的辅酶I、1KU/L的黄递酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的试剂II包括 1KU/L的13 -羟丁酸脱氢酶 2. P -羟丁酸测定 1)反应过程在0. 225ml的试剂I {100,1/LTris-HCL缓冲液、pH值为8. 5的20,1/L的草 酸、2. 5mmol/L的辅酶I、1KU/L的黄递酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫}中加入L的 0 4. 5mmol/L的P -羟丁酸，并置于37。C水浴5分钟，并读取吸光度A0，加入0. 075ml的 试剂II (1KU/LP -羟丁酸脱氢酶)，37t:水浴5分钟后，读取吸光度Al， AA = Al-AO。 2)计算及结果 |3 -羟丁酸的含量计算按以下公式进行计算 P -羟丁酸浓度(mmol/L) = ECX A Ax/ A Ac ; 其中AX =样本吸光率A5。5 Ac =标准品吸光率A5。5 Ec = |3 -羟丁酸标准品浓度(mmol/L)， 结果13 -羟丁酸线性范围0 4. 5mmol/L。 —种用酶比色反应测定13 -羟丁酸的方法配用的试剂盒，所述的试剂盒由以下成 分组成包括试剂I，试剂II、 P-羟丁酸标准品、P-羟丁酸异常血清对照以及266测试/ 盒，所述的试剂I包括lOOmmol/L的Tris-HCL缓冲液、pH值为8. 5的20mmol/L的草酸、 2. 5mmol/L的辅酶I、1KU/L的黄递酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的试剂II包括 1KU/L的13 -羟丁酸脱氢酶，所述的试剂I为120ml，试剂II为40ml，所述的每个试剂盒包 含试剂I 一瓶60ml、试剂II 一瓶20ml、 P -羟丁酸标准品一瓶lml、 P -羟丁酸异常血清对 照一瓶lml，检测介质血清，主要本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用酶比色反应测定β－羟丁酸的方法，其特征是：β－羟丁酸与辅酶Ｉ在β－羟丁酸脱氢酶的催化下脱氢生成乙酰乙酸和还原型辅酶Ｉ，生成的还原型辅酶Ｉ和碘硝基四氮唑紫在黄递酶的催化下反应生成最高吸光率在５０５ｎｍ处的红色物质甲月替（ｆｏｒｍａｚａｎｅ），并在５０５ｎｍ波长处测定红色物质甲月替（ｆｏｒｍａｚａｎｅ）吸光度的变化来定量生物样本中β－羟丁酸的含量，其反应方程式如下：β－羟丁酸＋辅酶Ｉ＊→乙酰乙酸＋还原型辅酶Ｉ＋氢离子还原型辅酶Ｉ＋碘硝基四氮唑紫＊→甲月替（ｆｏｒｍａｚａｎｅ）＋辅酶Ｉ。
【技术特征摘要】
一种用酶比色反应测定β-羟丁酸的方法，其特征是β-羟丁酸与辅酶I在β-羟丁酸脱氢酶的催化下脱氢生成乙酰乙酸和还原型辅酶I，生成的还原型辅酶I和碘硝基四氮唑紫在黄递酶的催化下反应生成最高吸光率在505nm处的红色物质甲月替(formazane)，并在505nm波长处测定红色物质甲月替(formazane)吸光度的变化来定量生物样本中β-羟丁酸的含量，其反应方程式如下F2009101556381C00011.tif2. 根据权利要求l所述的一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法，其特征是上述的反应过程具体为在0. 225ml的试剂I中加入6 ii L的0 4. 5mmol/L的P -羟丁酸，并置 于37t:水浴5分钟，并读取吸光度AO，加入0. 075ml的试剂11，37t:水浴5分钟后，读取吸 光度Al， AA = Al-AO。3. 根据权利要求2所述的一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法，其特征是所述 的试剂I包括100mmol/L的Tris-HCL缓冲液、pH值为8. 5的20mmol/L的草酸、2. 5mmo1/ L的辅酶I、1KU/L的黄递酶以及lmmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的试剂II包括1KU/L的 P-羟丁酸脱氢酶。4. 根据权利要求3所述的一种用酶比色反应测定P-羟丁酸的方法，其特征是P-羟 丁酸的含量计算按以下公式进行计算P -羟丁酸浓度(mmol/...
【专利技术属性】
技术研发人员：张闻，
申请(专利权)人：张闻，
类型：发明
国别省市：97[中国|宁波]
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