本发明专利技术公开了一种重组人细胞静息因子ＭＨＤ融合蛋白及其制备方法，该融合蛋白包括人细胞静息因子ＭＨＤ结构域，在人细胞静息因子ＭＨＤ结构域的Ｎ端还依次连接有纯化标记序列、凝血酶和肠激酶酶切位点，以及Ｎｕｓ序列。本发明专利技术通过构建原核表达载体ｐＥＴ４４ａ（＋）－Ｒｅｓｔｉｎ－ＭＨＤ－ＭＨＤ，并转化入大肠杆菌获得转化体，再对大肠杆菌转化体进行诱导表达，分离纯化后得到Ｒｅｓｔｉｎ－ＭＨＤ融合蛋白。生物活性验证表明，对Ｒｅｓｔｉｎ融合蛋白对肿瘤细胞具有细胞周期阻滞作用，可用于抗肿瘤药物的制备。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及重组融合蛋白的表达，特别涉及一种重组人细胞 静息因子MHD融合蛋白及其制备方法。
技术介绍
细胞静息因子(Restin)是1999年由zhu等人克隆得到的一个属于黑色素瘤相关 JfiJ^ (melanoma associated antigen, MAGE)胃方矣白勺§ ]^員。Restin1475bp，IS 码219个氨基酸，基因产物在不同的细胞系中定位不同，胞浆和细胞核中都有表达。Restin蛋白N末端8_25位氨基酸为一个典型的二分裂核定位信号序列，42-52位 氨基酸为casein kinase II磷酸化位点，该位点的磷酸化对于Restin蛋白的核定位也有 影响；88-176位氨基酸为MAGE家族同源结构域MHD，该结构域理论pi值为9. 99，因此将 Restin蛋白定位为碱性MAGE蛋白。研究认为，Restin与细胞周期分化相关，细胞内过表达Restin观察细胞生长周 期，发现G1期阻滞，提示其可能参与细胞分化进程。文献表明，Restin的高度同源蛋白 Necdin也具有细胞生长周期阻滞的生物学功能的，而其MHD中的191-222位氨基酸对细胞 的生长抑制起至关重要的作用。蛋白质序列比对发现，Restin的另一个同源蛋白MAGE-Dl 的MHD中也含有该序列，说明该序列在进化上高度保守；并且对于MAGE-Dl的研究发现，其 也参与细胞的分化进程。而Restin MHD中的92-122位氨基酸与该保守序列的同源性为 48 %，提示其在Restin产生细胞周期阻滞过程中有重要作用。鉴于Restin重要的生物学功能，获得高纯度有活性的Restin蛋白，可作为抑制肿 瘤细胞周期的基因药物，具有应用于肿瘤治疗的前景。而由于restin基因的mRNA 二级结 构复杂，不利于原核系统的外源表达；且Restin全长蛋白的分子量较大，为24. 4kD，也会影 响后期基因药物的效率；此外，Restin-MHD多肽可以针对Π类MAGE分子，较Restin具有更 广泛的靶效应。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供一种重组人细胞静息因子MHD融合蛋白及其制备方 法，对Restin的黑色素瘤相关抗原同源结构域进行了克隆和表达，并验证了该融合蛋白对 肿瘤细胞周期的阻滞作用。本专利技术是通过以下技术解决方案来实现一种重组人细胞静息因子MHD融合蛋白，包括人细胞静息因子MHD结构域，在人细 胞静息因子MHD结构域的N端还依次连接有纯化标记序列、凝血酶和肠激酶酶切位点，以及 Nus序歹丨J。所述的人细胞静息因子MHD结构域的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。所述的纯化标记序列为6XHis的标记序列。所述的重组人细胞静息因子MHD融合蛋白的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。一种表达重组人细胞静息因子MHD融合蛋白的原核表达载体，该原核表达载体为 pETAAaw-Restin-mD，是通过Bam Hi/Hind III酶切位点将如SEQ. ID. NO. 3所示的人细胞静 息因子MHD基因片段，克隆入pET44a(+)表达载体。一种重组人细胞静息因子MHD融合蛋白的制备方法，包括以下步骤1)以包含完整人Restin基因编码框的cDNA为模板，以引物对P作为引物，PCR扩 增人Restin-·基因片段，所述的引物对P为上游弓I物 Plgaaaagtctc ct ；下游弓I物 P2 :cccaagcttg actttcagtt tgc ；2)将PCR扩增的人Restin-MHD基因片段用Bam Hi/Hind III双酶切得到带粘性 末端的片段；并将该片段与Bam Hi/Hind III双酶切的pET44a(+)载体连接得到表达载体 pET44a(+)-Restin-MHD ；3)将表达载体pET44a(+)-ReStin-·转染到感受态的大肠杆菌，筛选得到目的基因 表达的阳性转化子；4)将阳性转化子在37°C恒温箱培养12h后挑取边缘整齐、生长状态良好的菌 落，接种于含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，摇床37°C培养过夜；次日以1 100 的体积比接种于新鲜的含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，37°C继续培养至细菌密 度达到OD6tltl = 0. 4 0. 6，加入0. 1 2. 5mM浓度的IPTG诱导培养4h，使得表达载体 pET44a(+)-Restin-MHD得到表达，然后离心收集细菌；5)按10mL/g细菌沉淀的比例加入裂解液，重悬细菌，在冰浴下超声裂菌，然后离 心分离，并收集上清；所述的裂解液为pH 8. 5、浓度50mmol/L的Tris · Cl，5mmol/L的β -巯基乙醇和 lmmol/L的PMSF的混合溶液；6)将收集的上清上样于金属螯合亲和层析柱，用10倍柱体积的缓冲液A洗柱以 0. 5mL/min的流速洗脱，然后用2倍柱体积的缓冲液B洗柱，最后用缓冲液C洗脱结合蛋白， 收集洗脱峰；所述的缓冲液8. 5、浓度 20mmol/L 的 Tris .Cl，100mmol/L 的 KC1，5mmol/L 的β _巯基乙醇和20mmol/L的咪唑的混合溶液；所述的缓冲液B为pH 8. 5、浓度20mmol/L 的Tris · Cl，lmol/L的KCl和5mmol/L的β -巯基乙醇的混合溶液；所述的缓冲液C为pH8.5、浓度 20mmol/L 的 Tris · Cl, IOOmmol/L 的 KCl，5mmol/L 的 β -巯基乙醇和 100mmol/L 的咪唑的混合溶液；将收集的洗脱峰上样于离子交换层析，用洗脱液D洗脱结合的蛋白，收集洗脱峰， 得到纯化的重组人细胞静息因子MHD融合蛋白；所述的洗脱液D为pH 7. 4、浓度50mmol/L的Tris · Cl和lmmol/LNaCl的混合溶 液。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果1、由于Restin为碱性蛋白质，其理论pi值为9. 05，Restin结构域理论PI值为9.99，从而决定了此蛋白较难表达。而本专利技术通过构建原核表达载体pETA^M-Restin-·， 并转化大肠杆菌，进行诱导表达之后分离纯化得到具有Restin融合蛋白的重组人细胞静 息因子MHD结构域的融合蛋白，该融合蛋白具有抑制肿瘤细胞周期的生物活性，对肿瘤细胞具有细胞周期的阻滞作用，可以用于制备抗肿瘤药物。本专利技术构建的原核表达载体pET44a(+)-ReStin-·是在克隆人Restin-MHD基因结 构域的基础上，通过Bam Hi/Hind III双酶切位点克隆入表达载体pET44a(+)，连接能够被凝 血酶和肠激酶识别的序列，而且构建的Restin-MHD融合蛋白还包含6XHis的纯化标记序 列，这样便于融合蛋白的纯化；并且在必要的时候通过凝血酶和肠激酶的限制性酶切反应 可以去除标记序列，从而能够得到Restin-·多肽。Restin-·多肽可以针对Π类MAGE分 子，较Restin具有更广泛的靶效应。该融合蛋白利用原核大肠杆菌系统进行表达，具有经济，易于扩大培养的优势，融 合蛋白促使表达量大大增加，纯化标签易于纯化，产量高，纯度高都是该融合蛋白的优势。附图说明图1是PCR扩增获得Restin-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人细胞静息因子ＭＨＤ融合蛋白，其特征在于，包括人细胞静息因子ＭＨＤ结构域，在人细胞静息因子ＭＨＤ结构域的Ｎ端还依次连接有纯化标记序列、凝血酶和肠激酶酶切位点，以及Ｎｕｓ序列。
【技术特征摘要】
一种重组人细胞静息因子MHD融合蛋白，其特征在于，包括人细胞静息因子MHD结构域，在人细胞静息因子MHD结构域的N端还依次连接有纯化标记序列、凝血酶和肠激酶酶切位点，以及Nus序列。2.如权利要求1所述的重组人细胞静息因子MHD融合蛋白，其特征在于，所述的人细胞 静息因子MHD结构域的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。3.如权利要求1所述的重组人细胞静息因子MHD融合蛋白，其特征在于，所述的纯化标 记序列为6 X Hi s的标记序列。4.如权利要求1所述的重组人细胞静息因子MHD融合蛋白，其特征在于，所述的重组人 细胞静息因子MHD融合蛋白的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。5.一种表达重组人细胞静息因子MHD融合蛋白的原核表达载体，其特征在于，该原核 表达载体为pETAAaw-Restin-^ ，是通过Bam Hi/Hind III酶切位点将如SEQ. ID. NO. 3所 示的人细胞静息因子MHD基因片段，克隆入pET44a(+)表达载体。6.一种重组人细胞静息因子MHD融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1)以包含完整人Restin基因编码框的cDNA为模板，以引物对P作为引物，PCR扩增人 Restin-·基因片段，所述的引物对P为上游弓丨物 Pl :cgggatccaa gaaaagtctc ct ；下游弓I物 P2 :cccaagcttg actttcagtt tgc ；2)将PCR扩增的人Restin-·基因片段用BamHi/Hind III双酶切得到带粘性末 端的片段；并将该片段与Bam Hi/Hind III双酶切的pET44a(+)载体连接得到表达载体 pET44a(+)-Restin-MHD ；3)将表达载体pET44a(+)-Restin-·转染到感受态的大肠杆菌，筛选得到目的基因表达 的阳性转化子；4)...
【专利技术属性】
技术研发人员：路凡，王卫华，吴有盛，王莉，王孝功，沈琦，药立波，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]
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