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酶偶联法测定生物样品中草酸含量的试剂盒及其检测方法技术

技术编号:3969144 阅读:350 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术涉及一种酶偶联法测定生物样品中草酸含量的试剂盒,包括:样品前处理试剂盒及样品反应试剂盒;其检测步骤包括:待测样品先经前处理,去除酶反应抑制物和干扰物;在处理后的样品溶液中添加草酸脱羧酶,于15-60℃反应20-60min;加入辅酶I的溶液和去离子水,测定吸光值A1;再加入甲酸脱氢酶反应15-60min,测定反应液的吸光值A2;另做一空白样品进行对照,最后根据测得的吸收值计算得出草酸的含量。本发明专利技术的检测试剂盒具有灵敏度高,稳定性强,操作方便,使用试剂及设备成本低,可测定多种不同来源的样品,应用范围广,与其它市售的测定草酸的试剂盒相比精确度高,有很好的实用性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物样品中草酸含量的检测分析领域,特别涉及一种酶偶联法测定生物样品中草酸含量的试剂盒及其检测方法
技术介绍
草酸是自然界中广泛存在的一种有机羧酸,多是以草酸盐的形式存在,是生物体 生长过程中的一种代谢产物。草酸的代谢生成主要源自于三羧酸的循环和乙醛酸的循环。 草酸能够与体内的一些金属离子络合形成化合物。 在生物体内,草酸水平过高形成草酸盐积累会对生物体产生一定的毒性。例如 在一些植物(豆类、番茄、向日葵等)中,草酸盐的积累会导致植物营养缺失、生长停滞等相 关症状。已有的研究表明,草酸不仅对植物有害而且对包括人类在内的几乎所有生物都有 毒害作用。在人类和其它脊椎动物中,由于草酸盐的积累易产生尿结石、肾结石、高草酸尿、 低血钙症、维生素B6缺乏等症状。人体内的草酸既是甘氨酸和维生素C的代谢产物,也可 以经由食物(如菠菜、苋菜、白菜及茶叶等)摄入。体内草酸过多易患多种疾病,一方面由 于草酸只能经肾脏随尿液排泄,当体内草酸含量超标时,易引起肾脏负担过重导致器官功 能发生病变紊乱,如引起高草酸尿症(Primary Hyperoxaluria typel, PHI)、肾衰竭等病; 另一方面,由于Ca++、Mg++等多种金属离子和其它稀有元素与草酸根离子螯合形成盐或络合 物,从而导致^及一些微量元素从体内流失,进而产生低血*丐症、维生素B6缺乏症、尿结石 等多种疾病。在一些工业生产中,由于草酸络合金属离子产生沉积,造成堵塞管道、筛孔等 现象。如制浆造纸以及啤酒工业经常会遇到这些问题。 因此,人们在应用实践中需要检测一些不同来源样品的草酸含量,如在食品中检 测草酸含量以对人民健康负责,在工业样品中检测草酸含量以判断引起管道和筛孔堵塞的 临界草酸浓度。目前检测草酸的手段主要有滴定法、原子吸收法、比色法、高压液相色谱法、 离子色谱法、毛细管电泳法、酶法及酶_电极法。 滴定法建立最早,作为一种经典方法至今仍在食品分析中广泛应用,但发展不大, 毛细管电泳灵敏度高,操作也较简便,但该仪器尚未普及。高效液相色谱法(HPLC)灵敏度 高,重复性好,操作简便,快捷,但分离过程中无机酸的干扰较严重,且仪器昂贵,对操作人 员的要求较高,普及困难,难以大范围使用,尤其是在一线工业生产或食品生产厂家使用。 艾玉玲等在专利200710021171中公布了一种化学显色比色法测定双草酸硼酸锂中草酸含 量,该方法灵敏度低,操作较繁琐、耗时的缺陷没有改善。比色法廉价、灵敏度高,但预沉淀 操作难于完全将草酸提取出来,操作繁琐且重复性较差。酶法及酶_电极法检测草酸简便 快速,灵敏度高,选择性好,回收率高,将酶法的放大作用、良好选择性与电极法的快速简便 有机的结合了起来,是一种很有前途的检测方法。综合比较可知,高效液相色谱法与酶法及 酶_电极法是两种较有前途的草酸检测方法。 目前的酶法及酶-电极法均是利用草酸氧化酶(Oxalate oxidase)催化草酸与 氧气生成二氧化碳和过氧化氢的特性,通过检测氧气的消耗量,或二氧化碳、过氧化氢的生成量来定量测定草酸。草酸氧化酶主要存在于植物中,譬如菠菜、辣椒叶、甜菜叶与茎、高 粱根茎叶、大麦苗和根以及小麦苗等,玉米的根和茎等中,其中以大麦苗中的含量最高,因 此目前大麦源的草酸氧化酶使用最频繁。在该酶法检测中,通常Cl—、 N03—、 SCN—及一些阳 离子等会抑制酶活力,干扰测定结果。王尔中在专利200710024719. 9、200710024720. 1、 200710024721. 6、200710024722. 0、200710024723. 5、200710024724. X、200710024725. 4中 公布了一种草酸氧化酶比色法及酶联法技术的草酸诊断/测定试剂盒,灵敏度高,选择性 好,回收率高,将酶法的放大作用、良好选择性与电极法的快速简便有机地结合了起来。 酶法及酶-电极法简便、精确度高,是目前测定草酸的经典方法。但是由于该技术 所用的草酸氧化酶造价较高,该法的大范围推广应用受到了很大限制。该法的大规模推广 应用将有待于草酸氧化酶高效低成本制备技术的突破。因此急需寻找一种可替代该经典方 法,且耗时短、价格较便宜、精确度和重现性高、操作简单方便的测定草酸的切实可行的分 析方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种酶偶联法测定生物样品中草酸含量的试 剂盒及其检测方法,该检测试剂盒具有灵敏度高,稳定性强,操作方便,使用试剂及设备成 本低,可测定多种不同来源的样品,应用范围广,与其它市售的测定草酸的试剂盒相比精确 度高,有很好的实用性。 所述的缓冲溶液B为100-200mM磷酸-磷酸氢二盐缓冲液、巴比妥盐_盐酸缓冲 液Jris-盐酸缓冲液、硼酸_硼砂缓冲液、甘氨酸_氢氧化钠缓冲液、硼砂_氢氧化钠缓冲 液或者其它缓冲液,缓冲溶液B的pH为9. 0 9. 5,离子强度100-200mM ; 所述的缓冲溶液C为含20-200mM磷酸氢二盐_柠檬酸、柠檬酸_柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、甘氨酸_盐酸缓冲液、邻苯二甲酸_盐酸缓冲液、柠檬酸_氢氧化钠_盐酸 缓冲液或者其它缓冲液,缓冲溶液C的pH为1. 5 5. 6,离子强度20-200mM。 本专利技术的一种生物样品中草酸含量的检测方法,包括如下步骤 (1)待测样品的前处理 将待测样品与上述缓冲溶液A按体积比1 : 1 5混合配成混合液,检查pH是否 在5. 0 10. 0,如果不是,用酸和碱将pH调至5. 0 10. 0,加入与混合液0. 05 0. 5g/mL 的活性碳共混2 20min,期间偶尔搅动或旋转混匀一下,再经抽滤或离心10-30min,去除 酶反应抑制物和干扰物,得上清液; (2)草酸脱羧酶催化草酸生成甲酸反应体系的构建 空白样品的准备量取0. 3mL上述缓冲溶液C, 0. lmL经前处理的待测样品溶液,混 合备用; 待测样品的准备量取0. 3mL上述缓冲溶液C, 0. lmL经前处理的待测样品溶液,混 合备用; 第一步草酸脱羧酶催化草酸生成甲酸反应体系,经前处理的待测样品通过加 入0. lmL酶活> 0. 8U/mL的草酸脱羧酶启动反应(总体积为0. 5mL);空白样品则不加 入草酸脱羧酶(总体积为O. 4mL),反应pH为1.5-4.5,反应温度为15-60°C,反应时间为 20-60min ; (3)第二反应体系 将辅酶I (NAD+)溶于缓冲溶液B中,配成9. 35mg/mL的溶液D ; 空白样品组在第一步反应体系的酶催化反应空白样品液中加入2. OmL上述溶液D和0. 55mL去离子水; 待测样品组在第一步反应体系的酶催化反应待测样品液中加入2. OmL上述溶液 D和0. 45mL去离子水; 第二反应体系总体积为2. 95mL,混合l_5min后,于340nm处分别读取吸光值A工; (4)第三反应体系 空白样品组在第二步反应体系中加入0. 05mL甲酸脱氢酶,混合后在15-6(TC的 水浴中反应15-60min,于340nm处读取样品的吸收值A2,计算AAee= A厂Ai ; 待测样品组在第二步反应体系中加入0. 05mL甲酸脱氢酶,混合后在15_60°C的 水浴中反应15-60mi本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种酶偶联法测定生物样品中草酸含量的试剂盒,包括:(1)样品前处理试剂盒活性碳吸附剂0.1~1g;缓冲溶液A2~10mL;以上所述的药品和试剂的用量只针对2mL待测样品;(2)样品反应试剂盒,包括:草酸脱羧酶,酶活>0.8U/mL0.1mL×2;辅酶Ⅰ,即NAD↑[+]18.7mg×2缓冲溶液B2.0mL×2;缓冲溶液C0.3mL×2甲酸脱氢酶,酶活>40U/mL0.05mL×2;0.2-1.0mM草酸标准品2.0mL;以上所述的药品和试剂的用量仅针对1份0.1mL样品和1份空白对照。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:洪枫曹张军杨光
申请(专利权)人:东华大学
类型:发明
国别省市:31[中国|上海]

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