本发明专利技术涉及一种从猪胰脏中提取胰激肽原酶的方法，主要提供一种离子层析柱填料及胰激肽原酶纯化方案，所述填料以聚甲基丙烯酸酯为基质，甲基化并偶联乙二胺，形成一种新型离子填料，用于纯化胰激肽原酶。所述离子填料稳定性强，用于纯化胰激肽原酶分辨率高，除杂效果好。通过一步离子纯化，可以高效、绿色、规模化生产高纯度胰激肽原酶。生产高纯度胰激肽原酶。生产高纯度胰激肽原酶。
【技术实现步骤摘要】
一种纯化胰激肽原酶的层析柱及其应用
[0001]本专利技术涉及生物
，具体是涉及一种从猪胰脏中提取胰激肽原酶的方法。
技术介绍
[0002]胰激肽原酶系自猪胰中提取的蛋白酶，为类白色或淡褐色粉末，无臭，易溶于水。胰激肽原酶是胰激肽释放酶的前体，在体内可激活生成胰激肽释放酶。胰激肽释放酶为内切性蛋白水解酶，具有高度的专一性，对于高分子量或低分子量的激肽原均有作用，胰激肽原酶在体内作用于激肽原释放出激肽，从而释放出胰激肽，胰激肽具有非常强的生理效应，能使微血管舒张，有舒展毛细血管和小动脉作用，使冠状动脉、脑、视网膜等处的血流供应量增加，血压下降。舒张微小动脉和毛细血管，改善微循环。激活磷酸脂酶A2，促使肾髓质分泌前列腺素E2，抑制氧化应激，增加血流量。促进前列环素(PGI2)分泌，抑制血栓素(TXA2)生成，避免血小板过度聚集，降低血粘度，预防血栓形成，避免加重肾脏微循环损害。胰激肽原酶作为一种国际公认的微循环改善剂，是一种疗效确切、不良反应轻微的酶类药物，适宜于长期服用，适用于各种微血管循环障碍疾病的治疗。胰激肽原酶对早期肾病的治疗效果显著，能有效地改善肾脏的微循环，与其它药物配合治疗，能降低肾小球入球动脉压，具有促使肾小球基底膜早期损伤修复等作用，该产品的市场前景十分广阔。临床主要用于高血压、冠状血管及动脉血管硬化等症，对心绞痛、血管痉挛、肢端感觉异常、冻疮等症有减轻症状作用。
[0003]胰激肽原酶是从哺乳动物的胰脏中经提取纯化而得到的，即从胰脏本身、胰酶粉以及胰激肽原酶粗品(中间体)中提取，并通过纯化而制得。现有胰激肽原酶的纯化方法包括使用多糖非树脂物料进行纯化，例如使粗的胰激肽原酶吸附到一种弱碱性阴离子交换纤维素上并分离(见US4038141A)。
[0004]然而，利用上述多糖型非树脂物料进行吸附的方法缺点是离子交换物料的物理强度不够，不能进行大规模制备。而阴离子交换纤维素或交联葡聚糖(Sephadex)，分辨率低、除杂效果差。
技术实现思路
[0005]本专利技术主要提供一种离子填料及纯化方案，所述填料以聚甲基丙烯酸酯为基质，甲基化并偶联乙二胺，形成一种新型离子填料，用于纯化胰激肽原酶。新型离子填料稳定性强，用于纯化胰激肽原酶分辨率高，除杂效果好。通过一步离子纯化，可以高效、绿色、规模化生产高纯度胰激肽原酶。
[0006]在一个方面，本专利技术提供了一种从猪胰中提取胰激肽原酶的方法，采用缓冲液浸提，硫酸铵盐析得到胰激肽原酶粗品，粗品再经离子层析纯化、浓缩除盐、冷冻干燥得胰激肽原酶纯品。
[0007]在一个实施例中，本专利技术提供了一种纯化胰激肽原酶的层析柱，所述层析柱中离子填料制备方法包括：以聚甲基丙烯酸酯为基质，甲基化并偶联乙二胺的一种阴离子填料。
[0008]在一个实施例中，所述离子填料制备方法包括：
[0009]a、取聚丙烯酸酯微球，溶于甲苯中，搅拌溶胀。优选地，聚丙烯酸酯微球与甲苯的用量比为1:1～1:10g/mL，优选为1:7g/mL；优选地，聚丙烯酸酯微球粒径为10
‑
250μm，优选为80
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120μm；优选地，室温下搅拌溶胀时间为1～5小时，优选为室温下搅拌溶胀时间为3小时；
[0010]b、然后加入30mL氯甲醚及3mL氯化锡，并搅拌。优选地，聚丙烯酸酯微球与氯甲醚的用量比为1:1～1:10g/mL，优选为1:3g/mL；聚丙烯酸酯微球与氯化锡的用量比为1:0.1～1:1g/mL，优选为1:0.3g/mL；优选地，室温下搅拌1～5小时，优选为室温下搅拌3小时；
[0011]c、取上述甲基化微球，加入三氯甲烷中，再添加乙二胺搅拌加热，反应一定时间，降温、清洗，即得阴离子填料。优选地，聚丙烯酸酯微球与三氯甲烷的用量比为1:1～1:50g/mL，优选为1:20g/mL；优选地，聚丙烯酸酯微球与乙二胺的用量比为1:1～1:50g/mL，优选为1:10g/mL；优选地，搅拌加热至100℃；优选的，加热至100℃后搅拌1
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5小时，优选为3小时；优选地，降至室温，用纯水、乙醇清洗；优选地，制得的阴离子填料用20％乙醇保存。
[0012]在一个方面，本专利技术提供了一种应用上述离子层析柱纯化的方法。
[0013]在一个实施例中，所述纯化方法为：离子填料前平衡
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胰激肽原酶粗酶液过填料
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后平衡
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洗脱收集胰激肽原酶液
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胰激肽原酶酶液膜包除盐。
[0014]在一个实施例中，所述离子填料为上述制得的阴离子填料。
[0015]在一个实施例中，应用上述离子层析柱纯化的线性流速为100cm/h
‑
300cm/h。
[0016]在一个实施例中，胰激肽原酶粗品保存缓冲液为Tris
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HCL、Na2HPO4‑
NaH2PO4、MES一种或几种，浓度20mM
‑
100mM，pH＝6.0
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7.0。
[0017]在一个实施例中，平衡缓冲液为Tris
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HCL、Na2HPO4‑
NaH2PO4、MES、MOPS、HEPES中的一种或几种，浓度20mM
‑
100mM，pH＝6.0
‑
7.0。
[0018]在一个实施例中，洗杂缓冲液为Tris
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HCL、Na2HPO4‑
NaH2PO4、MES、MOPS、HEPES中的一种或几种，浓度10mM
‑
100mM，含氯化钠
[0019]0.1～0.5mol/L，pH＝6.0
‑
7.0。
[0020]在一个实施例中，洗脱收集缓冲液为Tris
‑
HCL、Na2HPO4‑
NaH2PO4、MES、MOPS、HEPES中的一种或几种，浓度20mM
‑
100mM，含氯化钠0.1～0.5mol/L，pH＝6.0
‑
7.0。
[0021]在一个实施例中，膜包选用10KD规格。
[0022]在一个实施例中，平衡缓冲液为MES，浓度50mM，pH＝6.0。洗杂缓冲液为MES，浓度50mM，pH＝6.0。洗脱收集缓冲液为MES，浓度50mM，含氯化钠0.2mol/L，pH＝6.0。
[0023]技术效果：
[0024]本专利技术提供了一种离子填料制备层析柱及应用上述层析柱纯化胰激肽原酶，通过一步离子纯化，可以高效、绿色、规模化生产高纯度胰激肽原酶，其比酶活高达1500U/mg
·
pr，是药典标准的2.5倍及以上，为胰激肽原酶的高效、绿色获得提供了有效的产业化路径。
附图说明
[0025]图1聚丙烯酸酯微球与甲苯用量比对离子填料性能的影响
[0026]图2聚丙烯酸酯粒径对对离子填料性能的影响
[0027]图3聚丙烯酸酯微球与氯甲醚用量比对离本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种纯化胰激肽原酶的离子层析柱，其特征在于，所述层析柱中离子填料制备方法包括：以聚甲基丙烯酸酯为基质，甲基化并偶联乙二胺的一种阴离子填料。2.如权利要求1所述的层析柱，所述离子填料制备方法包括：a、取聚丙烯酸酯微球，溶于甲苯中，搅拌溶胀；优选地，聚丙烯酸酯微球与甲苯的用量比为1:1～1:10g/mL，优选为1:7g/mL；优选地，聚丙烯酸酯微球粒径为10
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250μm，优选为80
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120μm；优选地，室温下搅拌溶胀时间为1～5小时，优选为室温下搅拌溶胀时间为3小时；b、然后加入30mL氯甲醚及3mL氯化锡，并搅拌；优选地，聚丙烯酸酯微球与氯甲醚的用量比为1:1～1:10g/mL，优选为1:3g/mL；聚丙烯酸酯微球与氯化锡的用量比为1:0.1～1:1g/mL，优选为1:0.3g/mL；优选地，室温下搅拌1～5小时，优选为室温下搅拌3小时；c、取上述甲基化微球，加入三氯甲烷中，再添加乙二胺搅拌加热，反应一定时间，降温、清洗，即得阴离子填料；优选地，聚丙烯酸酯微球与三氯甲烷的用量比为1:1～1:50g/mL，优选为1:20g/mL；优选地，聚丙烯酸酯微球与乙二胺的用量比为1:1～1:50g/mL，优选为1:10g/mL；优选地，搅拌加热至100℃；优选的，加热至100℃后搅拌1
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5小时，优选为3小时；优选地，降至室温，用纯水、乙醇清洗；优选地，制得的阴离子填料用20％乙醇保存。3.一种纯化胰激肽原酶的方法，其特征在于，将胰激肽原酶粗品经离子层析柱纯化、浓缩除盐、冷冻干燥得胰激肽原酶纯品；所述离子层析柱为应用权利要求1
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2任一项所述的离子层析柱。4.如权利要求3所述的纯化胰激肽原酶的方法，其特征在于，所述离子层析柱纯化方法为：离子填...
【专利技术属性】
技术研发人员：王康林，王忠伟，安双双，李军，桑晓斌，汪晓东，
申请(专利权)人：开封康诺药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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