利用植物甾醇生产纳豆激酶脂质体的方法技术

本发明专利技术涉及一种生产纳豆激酶脂质体的方法。利用植物甾醇生产纳豆激酶脂质体的方法，其特征在于它包括如下步骤：１）原料的选取：按卵磷脂∶植物甾醇∶乙醚∶缓冲液∶纳豆激酶溶液＝１００～３００ｍｇ∶９０～２００ｍｇ∶２～５ｍＬ∶５～１０ｍＬ∶５～１０ｍＬ，备用；２）空白脂质体的制备：将卵磷脂、植物甾醇和乙醚混合，然后旋转蒸发使其成均匀类脂薄膜覆盖在梨形瓶内底部，向瓶中加入缓冲液，加入玻璃珠，在６０℃下旋转震荡３０～９０ｍｉｎ后，水浴超声１０～２０ｍｉｎ，然后冷冻干燥，得脂质体前体物质；３）水合：取纳豆激酶溶液，加入到脂质体前体物质中，氮气流下水合１０～２０ｍｉｎ，得到纳豆激酶脂质体。该方法工艺简单、能减少胆固醇对人体的影响。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生产纳豆激酶脂质体的方法。
技术介绍
纳豆激酶由纳豆菌发酵产生，其分子量远小于尿激酶、链激酶、组织型纤溶酶原激活剂，可由肠道自然吸收。纳豆激酶的体外、体内溶栓功能通过实验也已得到确定纳豆激酶的体内溶栓活性是纤溶酶血纤维蛋白溶酶的四倍，在体内作用持续时间长，最重要的一点是它还能激活人体内的组织型纤溶酶原激活剂，使之温和、持续地提高血液的纤溶活性。纳豆激酶能够降低纤维蛋白及血小板凝集率，预防动脉硬化，对血栓性疾病有改善作用。近年来，国内外对纳豆激酶的性质、作用机理、分离纯化等方面都进行了大量研究，许多国家已相继推出以纳豆激酶为原料的产品，多以口服胶囊的形式。但是利用度较低，产生的是全身作用。而将纳豆激酶制备为脂质体，静脉注射或口服，能直接作用于血管中的血栓；且可以降低纳豆激酶在其他组织器官中的浓度，降低药物副作用。脂质体是一种定向药物载体，由磷脂、胆固醇等为膜材包合而成，属于靶向给药系统的一种新剂型。它可以增强药物的亲细胞性，降低不必要的系统毒性，增强脂溶性药物在体液中的溶解性，调节药物释放模式。在药物研发的许多领域中都应用脂质体作为载体，并取得了很大进展。将纳豆激酶制成脂质体，可以提高其在体内的半衰期，降低用药剂量，提高用药的安全性。但是胆固醇在体内过量时会导致高胆固醇血症，对机体产生不利的影响。目前脂质体的合成方法有注入法、超声波分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、薄膜分散法等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种，该方法工艺简单，该方法生产的纳豆激酶脂质体能减少胆固醇对人体的影响。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是，其特征在于它包括如下步骤1) 原料的选取按卵磷脂植物甾醇乙醚缓冲液纳豆激酶溶液二ioo 300mg :90 200mg : 2 5mL : 5 10mL : 5 10mL，选取卵磷脂、植物甾醇、乙醚、缓冲液和纳豆激酶溶液，备用；所述的缓冲液由甘露醇溶解于磷酸缓冲液中而成，磷酸缓冲液甘露醇5 10mL :200 400mg，缓冲液的pH为7. 4;所述的纳豆激酶溶液中纳豆激酶的酶活性为1000 5000U/mL;2) 空白脂质体的制备将卵磷脂、植物甾醇和乙醚混合，然后旋转蒸发使其成均匀类脂薄膜覆盖在梨形瓶内底部，向瓶中加入缓冲液，加入玻璃珠，在6(TC下旋转震荡30 90min3后，水浴超声10 20min，然后冷冻干燥，得脂质体前体物质；3)水合取纳豆激酶溶液，加入到脂质体前体物质中，氮气流下水合10 20min，得到纳豆激酶脂质体。所述的植物甾醇为豆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇、谷甾烷醇或菜油烷醇中的任意一种或任意二种以上(含二种)的混合，任意二种以上(含二种)混合时为任意配比。所述的超声的条件是频率40Hz、功率500W。所述的冷冻干燥的条件是_10 0°C， lmbar，干燥时间10 20小时。本专利技术的有益效果是1) 制作简单本专利技术制作工艺简单，不需要复杂设备；2) 采用植物甾醇作为膜材，植物甾醇具有与胆固醇类似的结构，它不但是形成脂质体双分子层的基础物质，而且能有效降低有害低密度胆固醇的水平(减少了胆固醇对人体的影响)，起到预防心血管疾病的作用。利用植物甾醇生产纳豆激酶脂质体能够兼具植物甾醇和纳豆激酶的功效，对高血脂和心脑血管疾病具有重要的作用。3) 本专利技术制备得到的纳豆激酶脂质体，包封率高(44.4% 64.4%),粒径较小(100 300nra)，粒径分布范围窄，释放速度快，且释放完全；4) 纳豆激酶脂质体易于被人体吸收，可以有效避免胃肠的干扰。制备的纳豆激酶脂质体所用到的脂材毒性小，生物相溶性好，没有免疫反应。5) 纳豆激酶脂质体可以提高纳豆激酶在体内的半衰期，降低用药剂量，提高用药的安全性，既能延长纳豆激酶在体内的作用时间，又能迅速的发挥溶栓作用，达到理想的溶栓效果。6) 提高药物稳定性，将植物甾醇和纳豆激酶制成脂质体，受到类脂双分子层膜的保护，可以显著提高其稳定性。同时在进入体内之后，由于脂质体膜的保护，药物可以免受机体酶系统和免疫系统的降解。本专利技术制备的纳豆激酶脂质体经扫描电镜观察，为规则的圆形、无粘性。动态光散射测定脂质体的Zeta电位为-(51±3)mV，平均粒径为194.1nm的单室脂质体。本专利技术制备的纳豆激酶脂质体悬浮液在4'C时保存14天，纳豆激酶的包封率在80%以上，这说明脂质体在4'C时是非常稳定的。本专利技术制备的脂质体经动物实验研究表明对角叉菜胶引起的血栓具有明显的抑制作用，其效果优于相同剂量的纳豆激酶。具体实施例方式为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例进一步阐明本专利技术的内容，但本专利技术的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例h，它包括如下步骤l)空白脂质体的制备称取卵磷脂180mg，加入豆甾醇90mg，乙醚3ml，旋转蒸发使其成均匀类脂薄膜覆盖在梨形瓶内底部，向瓶中加入5mL、 0.02mol/L 、 pH7. 4的缓冲液酸缓冲液5mL，甘露醇360mg)，加入玻璃珠，然后在6(TC下旋转震荡60min，水浴超声20min(频率40Hz、功率500W)，然后冷冻干燥15h (-10 0。C， lmbar),得脂质体前体物质(空白脂质体)；2)脂质体的水合取5ml纳豆激酶溶液(纳豆激酶活性2500U/ml)，加入到脂质体前体物质中，氮气流下水合10min，得到纳豆激酶脂质体。纳豆激酶脂质体经测定酶活包封率为64. 4%。本专利技术制备的纳豆激酶脂质体经扫描电镜观察，为规则的圆形，无粘性。动态光散射测定脂质体的Zeta电位为-(51±3)mV,平均粒径为194.1nm的单室脂质体。本专利技术制备的纳豆激酶脂质体悬浮液在4'C时保存14天，纳豆激酶的包封率在80%以上，这说明脂质体在4'C时是非常稳定的。本专利技术制备的脂质体经动物实验研究表明对角叉菜胶引起的血栓具有明显的抑制作用，其效果优于相同剂量的纳豆激酶。实施例2:，它包括如下步骤1) 空白脂质体的制备称取卵磷脂270mg，加入谷甾醇90mg，乙醚5ml，旋转蒸发使其成均匀类脂薄膜覆盖在梨形瓶内底部，向瓶中加入10mL、 0.02mol/L、 pH7.4的缓冲液(磷酸缓冲液lOmL，甘露醇180mg),加入玻璃珠，然后在6(TC下旋转震荡45min，水浴超声20min(频率40Hz、功率500W)，然后冷冻干燥10h (-10 0°C， lmbar)，得脂质体前体物质(空白脂质体)；2) 脂质体的水合取10ml纳豆激酶溶液(纳豆激酶活性1000U/ml)，加入到脂质体前体物质中，氮气流下水合15min，得到纳豆激酶脂质体。纳豆激酶脂质体经测定酶活包封率为55. 2%实施例3:，它包括如下步骤1) 空白脂质体的制备称取卵磷脂270mg，加入豆甾醇90mg，乙醚3ml，旋转蒸发使其成均匀类脂薄膜覆盖在梨形瓶内底部，向瓶中加入8mL、 0.02mol/L 、 pH7. 4的缓冲液(磷酸缓冲液8mL，甘露醇270mg)，加入玻璃珠，然后在60'C下旋转震荡60min，水浴超声20min(频率40Hz、功率500W)，然后冷冻干燥15h (-10 0°C， lmbar)，得脂质体前体物质(即空白脂质体)；2) 脂质体的水合取5ml纳豆激酶溶液(纳豆激酶活性2500U/ml)，加入到脂质体前体物质中，氮气流本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用植物甾醇生产纳豆激酶脂质体的方法，其特征在于它包括如下步骤：　１）原料的选取：按卵磷脂∶植物甾醇∶乙醚∶缓冲液∶纳豆激酶溶液＝１００～３００ｍｇ∶９０～２００ｍｇ∶２～５ｍＬ∶５～１０ｍＬ∶５～１０ｍＬ，选取卵磷脂、植物甾醇、乙醚、缓冲液和纳豆激酶溶液，备用；　所述的缓冲液由甘露醇溶解于磷酸缓冲液中而成，磷酸缓冲液∶甘露醇＝５～１０ｍＬ∶２００～４００ｍｇ，缓冲液的ｐＨ为７．４；　所述的纳豆激酶溶液中纳豆激酶的酶活性为：１０００～５０００Ｕ／ｍＬ；２）空白脂质体的制备：将卵磷脂、植物甾醇和乙醚混合，然后旋转蒸发使其成均匀类脂薄膜覆盖在梨形瓶内底部，向瓶中加入缓冲液，加入玻璃珠，在６０℃下旋转震荡３０～９０ｍｉｎ后，水浴超声１０～２０ｍｉｎ，然后冷冻干燥，得脂质体前体物质；　３）水合：取纳豆激酶溶液，加入到脂质体前体物质中，氮气流下水合１０～２０ｍｉｎ，得到纳豆激酶脂质体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：董绪燕，陈洪，魏芳，袁钢友，李光明，赵元弟，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]