利用具有反式剪接功能的蛋白质内含子制备重组多肽制造技术

具有反式剪切活性的蛋白质内含子的Ｎ－端剪接结构域和Ｃ－端剪接结构域之间能够特异性结合。本发明专利技术用蛋白质内含子的一个剪接结构域（Ｎ－或Ｃ－端剪接结构域）作为载体蛋白与目标多肽融合表达；将另一个剪接结构域（Ｃ－或Ｎ－端剪接结构域）与支持介质交联，制备亲和柱，用来吸附并纯化上述含有目标多肽的融合蛋白。通过增加亲和层析柱洗涤液中的盐浓度，去除融合蛋白样品中的杂质；通过改变层析柱的ｐＨ、温度、或者加入含巯基基团的化学试剂，诱导蛋白质内含子的反式剪切，使目标多肽从融合蛋白中释放出来，并同时获得纯化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于重组多肽制备领域。利用具有反式剪切活性的蛋白质内含子的N-端 剪接结构域和C端剪接结构域之间的特异性相互作用，亲和纯化含有目标多肽的融合蛋 白，通过改变洗涤液的PH、盐浓度、温度、或者加入含巯基基团的化学试剂，诱导蛋白质内含 子的反式剪切使目标多肽从融合蛋白中释放出来，得到纯化。
技术介绍
随着基因组学和蛋白质组学的深入研究，越来越多的蛋白被发现。为了研究这些 蛋白质的生物功能，首先必须获得足够量的高活性、高纯度的样品。由于生物组织中的蛋白 成分非常复杂，而目标蛋白往往在组织中的含量很少，因此目前人们普遍采用基因工程而 很少采用组织提取的方法制备目标多肽。为了方便从宿主细胞或其培养液中将目标蛋白纯化，人们往往在目标蛋白的 N-端或C-端加上亲和纯化的标签。由于大多数的活性小肽在宿主细胞中的表达效率低、稳 定性差，通常必须采用和载体蛋白融合表达的方法来制备低分子量小肽。但这些 亲和纯化标签以及载体蛋白往往影响目标蛋白或小肽的生物活性，必须经过蛋白水解酶或 化学裂解试剂处理，才能使目标蛋白或小肽与亲和标签或载体蛋白分开。其中蛋白水解酶 的专一性较高，但缺点是酶制剂的价格非常昂贵，且有时也会出现非特性酶解作用； 化学裂解试剂虽然价廉，但存在裂解条件比较剧烈，容易使目标蛋白失去活性的缺陷。近年来，人们利用携带了亲和纯化标签的蛋白质内含子作为载体蛋白，来表达纯 化目标蛋白。蛋白质内含子(intein)是指前体蛋白中的一段插入序列，在蛋白质 翻译后的成熟过程中它能自我催化蛋白质的剪接作用(protein splicing)，使自身从前体 蛋白中切除，并将其两侧称为蛋白外显子(extein)的多肽片段以正常的肽键连接形成有 功能的成熟蛋白。蛋白质内含子和蛋白质外显子位于同一多肽链时产生的剪接作 用称为顺式剪接(cis-splicing)。蛋白质内含子通常含有N-端和C-端两个剪切结构域 (splicing domain)。一方面，蛋白质内含子N-端和C-端剪接区的功能具有相对独立性，当N-端的 Ser, Cys或Thr突变后，N-端的剪切功能丧失，但C-端的剪切功能仍保留；同样，当C-端 的Asn突变后，N-端的剪切功能仍然存在。另一方面，蛋白质内含子N-端和C-端剪接结构域的功能又相互依赖，只有在 C-端结构域存在时(即使该结构域C端Asn发生突变而丧失C-端剪接功能)，N-端结构域 才具有(N-端)剪接活性。同样，只有在N-端结构域存在时(即使该结构域N端Cys、Ser 或Thr发生突变而丧失了 N-端剪接功能)，C-端结构域才具有(C-端)剪接活性。基于蛋白质内含子的上述特性，人们通过定点突变，选择性地保留其N-端或C-端 剪接功能，成功地将蛋白质内含子融合表达系统用于目标蛋白的表达、纯化。图1显示 了将目标蛋白与携带了几丁质结合(CBD-tag)亲和纯化标签的蛋白质内含子的N-端融合表达，通过改变洗涤液的PH、温度、或者加入含巯基基团的化学试剂，使目标多肽从融合蛋 白中释放出来，从而避免使用昂贵的蛋白水解酶。但从大肠杆菌中纯化重组蛋白时，该方法 仍然存在一些缺点，主要包括(1)必须使用完整的蛋白质内含子作为载体蛋白。载体蛋白 分子越大、结构越复杂，往往影响融合蛋白的表达效率，减少目标多肽在融合蛋白中所占的 比例，降低融合蛋白复性加工的产率。(2)蛋白质内含子的突变体通常仍然存在本底水平的 剪接活性。该活性降低了目标多肽的回收率。特别是当目标蛋白对宿主细胞具有毒性时， 蛋白质内含子本底水平的剪接活性将影响宿主细胞的生长。(3)蛋白质内含子本身不能用 作亲和纯化的配基。为了提高融合蛋白的纯化效率，必须在蛋白质内含子的N-端或C-端 附加亲和纯化标签，这进一步降低了目标多肽在融合蛋白中所占的比例。除具有顺式剪接功能的蛋白质内含子外，人们还发现了具有反式剪切活性的蛋 白质内含子。反式剪切蛋白质内含子的N-端和C-端剪接结构域分别位于不 同的多肽链，当两个剪接结构域结合后仍能介导肽键的剪接，该剪接作用称为反式剪接 (trans-splicing) 0具有反式剪接功能的蛋白质内含子的一个重要结构特征是其N-端和 C-端剪接结构域之间具有一定的亲和力，能够形成稳定的复合物，有的甚至对高温、高盐及 变性剂(如尿素)具有一定的耐受性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的基因工程融合蛋白表达、纯化、加工系统。本专利技术根据具有反式剪接功能的蛋白质内含子的特性，利用其N-端和C-端剪接 结构域之间的特异性亲和力来建立一个新的基因工程融合蛋白表达、亲和纯化系统；利用 N-端和C-端剪接结构域相互独立而又相互依赖的剪切活性建立一个新的基因工程融合蛋 白切割、加工系统。我们以具有反式剪接功能的蛋白质内含子dnaE为例，用图2来对本专利技术的技术措 施进行说明。将失去剪接功能的dnaE蛋白质内含子的C-端结构域作为亲和层析的配基， 通过与S印harose交联制备亲和层析柱，用来纯化与dnaE蛋白质内含子的N-端剪接结构 域融合表达的目标多肽。利用高盐浓度的洗涤缓冲液去除杂蛋白后，通过加巯基试剂或改 变层析柱内的PH及温度，诱导N-端结构域的剪接活性，使目标多肽从融合蛋白中释放出来 并得到纯化。在该表达系统中，蛋白质内含子起到了载体蛋白、亲和纯化、肽键特异性裂解 三重功能，极大地方便了目标多肽的制备。与其它融合蛋白的表达、纯化方法相比，本专利技术采用反式剪接蛋白质内含子制备 目标多肽的方法具有多种优点。采用蛋白水解酶裂解载体蛋白和目标多肽之间肽键(使目 标多肽从融合蛋白中释放出来)的方法通常具有一定的局限性，包括制备的目标多肽不能 是该蛋白水解酶的抑制剂，以及蛋白水解酶价格比较昂贵，有时存在非特异性水解等。本发 明在采用反式剪接蛋白内含子制备目标多肽过程中，不需要使用蛋白水解酶，因此可用于 制备各种蛋白水解酶抑制剂。与完整的蛋白质内含子相比，其N-端或C-端结构域分子较 小、结构较简单，因此用作载体蛋白时一般不影响融合蛋白的表达效率，并可提高目标多肽 在融合蛋白中所占的比例，增加融合蛋白复性加工的产率。顺式剪接蛋白质内含子在细胞 内由于存在本底水平的剪切活性，因此往往不能用于制备对宿主细胞毒性较强的目标多肽 或蛋白。由于反式剪接蛋白质内含子的N-端剪接结构域和C-端剪接结构域分别在不同的细胞内表达，因而目标多肽与N-端或C-端结构域组成的融合蛋白在细胞内完全不具备剪 切活性(不存在本底水平的剪接作用，不会产生游离的目标多肽)，所以可用于制备对宿主 细胞毒性较强的多肽样品。当顺式剪接蛋白质内含子作为载体蛋白时，其本身不能用作亲 和纯化的配基，必须另外在蛋白质内含子的N-端或C-端附加亲和纯化标签，从而降低了 目标多肽在融合蛋白中所占的比例。由于反式剪接蛋白质内含子的N-端和C-端剪接结构 域的结合具有特异性，且形成的复合物是非共价键的，可通过改变PH(大于11或小于3)而 解离。因此当采用C-端剪接结构域作为载体蛋白时，N-端结构域就可用作亲和层析的配 基，并且交联了 N-端结构域的S印harose可以反复使用。此外，N-端和C-端剪接结构域 之间的结合通常不受目标多肽的影响。因此，与反式剪接蛋白质内含子N-端结构域交联的 本文档来自技高网...

【技术保护点】
用具有反式剪接功能的蛋白质内含子的Ｎ－端剪接结构域肽段作为亲和层析的配基与固相支持介质交联，制备亲和层析填料。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建宁，孙自勇，陆嵬，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]