肾综合征出血热诊断试纸条、制备方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种肾综合征出血热诊断试纸条、制备方法及检测试剂盒。该试纸条是在ＰＶＣ底板（７）上顺次相互搭接地粘贴样品吸收垫（１）、胶体金结合垫（２）、硝酸纤维素薄膜（５）、吸水垫（６）而形成的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，胶体金结合垫（２）由含有胶体金标记的羊抗人μ链抗体免疫金复合物的玻璃纤维素膜构成，硝酸纤维素薄膜（５）上设置有检测区（３）和质控区（４），在检测区（３）位置包被有汉坦病毒核衣壳蛋白抗原，在控制区（４）的位置包被有兔抗羊ＩｇＧ抗体；该诊断试纸条有较好的特异性和敏感性，且重复性好，能够实现对ＨＦＲＳ的早期快速诊断，该试纸条易于携带，操作简单，成本低廉，反应迅速，易于在基层医疗单位推广使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及疾病的诊断技术，特别涉及肾综合征出血热(HFRS)的早期快速诊断技术。
技术介绍
肾综合征出血热(HFRS)是由汉坦病毒引起的一种自然疫源性传染病。我国是HFRS 的高发区，目前大陆31个省、市、自治区均有病例发生，而且新的疫区不断出现，并 偶见爆发流行。该病的临床表现主要是发热、出血和肾脏损害，患者发病初期出现的发 热、头痛、全身酸痛等非特异性症状，与一些常见的传染病如流感、钩端螺旋体病等难 以鉴别，所以特异性的实验室诊断显得十分重要。汉坦病毒(Hantavirus, HV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)的一个属，该属的 一些病毒株可引起严重的人类疾病。HV基因组为分节断的单股负链RNA，由L、 M、 S 3 个基因片断组成，分别编码RNA聚合酶(RNA polymerase, RNAP)、囊膜糖蛋白 (glycoprotein, GP) Gl和G2、核衣壳蛋白(nucleocaps丄d protein, NP)。血清学 研究表明，汉坦病毒NP具有很强的抗原性和免疫原性，可以与汉坦病毒内的多种血清型 病毒的免疫血清产生交叉反应，表明汉坦病毒的NP具有共同的抗原决定簇，因而常用作 汉坦病毒的诊断抗原。NP在核苷酸序列上相对于包膜蛋白更保守，在不同血清型病毒中 的同源性较高，整体同源性达到50%，其中蛋白C端有85G/。的同源性。HFRS患者体内抗NP抗体出现最早，并且滴度高。此外，来自病毒感染的培养细胞 裂解液作抗原，其稳定性、安全性不十分理想，而重组抗原和单克隆抗体的出现进一歩 提高了检测的敏感性和特异性，为縮短检测时间提供可能。我们采用的NP抗原来源于 汉坦病毒株Z10核蛋白，Z10是浙江省卫生防疫站出血热重点实验室于80年代分离的一 个病毒株以其制成的I型疫苗，是我国最早被卫生部批准进行人体观察的疫苗，具有血 凝滴度高、抗原性强等特点。姚苹苹等以Z10株樣 ^"if歪白基因插入到原核表达载体pET28a，高效表达了核衣壳蛋白，经过IPTG诱导产 生抗原性以及稳定性良好的蛋白，进一步纯化后免疫家兔，发现其血清中有较强的免疫荧光抗体以及中和抗体。因此，该基因工程产物作为抗原在安全性、敏感性、特异性都 得到保障。目前，诊断肾综合征出血热常用的实验室检测方法有IgM抗体酶联免疫吸附试验 (MacELISA)、间接免疫荧光法(IFA)和逆转录聚合酶链反应(RT — PCR)等，由于操作复杂、 需要特殊仪器等原因，使其在基层单位的应用受到条件和速度的限制。
技术实现思路
本专利技术的任务是提供一种肾综合征出血热诊断试纸条,使其具有简便、快速、特异 好、灵敏度高、成本低廉、能在汉坦病毒感染的早期阶段提供特异性诊断依据、且适于 推广应用等特点。本专利技术的任务还在于提供一种包含本专利技术试纸条的用于诊断肾综合征出血热的检 测试剂盒。实现本专利技术的技术方案是本专利技术提供的这种肾综合征出血热诊断试纸条，是在PVC底板7上顺次相互搭接地 粘贴样品吸收垫l、胶体金结合垫2、硝酸纤维素薄膜(NC膜)5、吸水垫6而形成的胶 体金免疫层析试纸条，其特征在于，胶体金结合垫2由含有胶体金标记的羊抗人p链抗 体免疫金复合物的玻璃纤维素膜构成，硝酸纤维素薄膜5上设置有检测区3和质控区4， 在检测区3位置包被有汉坦病毒核衣壳蛋白抗原，该处使用的汉坦病毒核衣壳蛋白抗原为汉坦病毒重组核衣壳蛋白抗原HVrNP;在控制区4的位置包被有兔抗羊IgG抗体。本专利技术提供用于诊断肾综合征出血热的检测试剂盒，由本专利技术提供的肾综合征出血 热诊断试纸条、稀释液和使用说明书组成，所使用的稀释液为0.01%吐温-20的PBS溶液。本专利技术提供的肾综合征出血热诊断试纸条的制备方法，包括以下歩骤 (1)制备40 nm胶体金溶液，用40 nm胶体金标记羊抗人p链抗体，制得胶体金标记 的羊抗人)a链抗体免疫金复合物溶液；用金稀释液将该免疫金复合物溶液稀释至42 ng/ml，其PH为8. 2，以10 W/cm喷于0. 5 cmX31 cm玻璃纤维素膜上，制得胶体金 结合垫2，干燥后密封保存；(2)制备汉坦病毒重组核衣壳蛋白抗原HVrNP，并将其纯化；将纯化后的HVrNP抗 原用PH为7. 2的0. 01 mol/L PBS稀释成0. 4mg/ml工作浓度，包被于硝酸纤维素薄膜 (NC膜)5的检测区3;在距离检测区3 5鹏处的地方，包被工作浓度为2.5 mg/m 的兔抗羊IgG抗体作为质控区4， 37 'C干燥2小时，4 。C密封保存； (3) 将作为样品吸收垫1的玻璃纤维膜浸入0. P/。BSA封闭剂溶液中，然后室温干燥 保存备用；(4) 将上述制备好的胶体金结合垫2、包被了检测区和质控区的硝酸纤维素薄膜5、 经0. 1%BSA封闭剂溶液处理过的样品吸收垫1 ，以及吸水垫6组装到PVC底板7上，切 条后装入塑料外壳中，即制成本专利技术肾综合征出血热诊断试纸条。 本专利技术提供的肾综合征出血热诊断试纸条的制备方法和对比实验资料一、 材料离心机；分光光度计；漩涡混合器；77.4型磁力恒温搅拌器；BI(HX)T型XYZ-3000三维喷点仪；LN-5000切割机；硝酸纤维素膜Sartorius CN140、吸水膜、玻璃纤维膜、PVC底板；柠檬酸三钠(Na:,C6H507 2H20) ; Tween-20;氯金酸(HAuCL Cl3 4H20)为国药集团化学试剂有限公司产品；汉坦病毒重组核衣壳蛋白抗原(HVrNP)，按姚苹苹,刘合宾，朱函坪等在《中华流行病学杂志》2001,22 (5): 400.上发表的《汉坦病毒中国疫苗株Z10核蛋白免疫原性的研究》 一文所述方制备HVrNP抗原，用于NC膜的检测区既T线包被； 羊抗人p链抗体，sigma产品，用于制备免疫复合金； 兔抗羊IgG抗体，sigma产品，用于NC膜的控制区既C线包被； 汉坦病毒IgM诊断试剂盒(酶联免疫法)购于上海钰森生物技术有限公司，用于对比实验；血清样本52份肾综合征出血热病人样本，30份正常血清样本来自武汉协和医院 门诊就医者(排除HFRS); 50份肝炎患者血清样本。二、 本专利技术试纸条的制备方法 1.免疫胶体金的制备(1) 胶体金的制备(40 nm):量取去离子水800 ml于锥形瓶中，加入2%氯金酸溶液8 ml得到终浓度为0. 02 % 的氯金酸水溶液，煮沸后准确加入1%柠檬酸三钠45 ml。继续加热煮沸，溶液颜色由 淡黄色变成黑色，继续煮沸直至溶液逐渐稳定成红色。再加热5min后冷却至室温，用 去离子水恢复至原体积800 ml。(2) 目测法确定胶体金与待标记羊抗人p链抗体量的比例用0. 1 mol/L K2C(V溶液调节金标溶液PH至8. 2，取洁净试管分装胶体金1 ml，加入不同稀释度的待标记羊抗人H链抗体(0. lmg/ml)，并设立空白对照管。放置5min后 加入10y。NaCl 0. 1 ml，混匀，静置2 h以上观察结果未加抗体或者抗体量不足的试管 中，胶体金不稳定形成由红色变成蓝紫色的聚沉现象，如果加入抗体的量到达或超过最 低稳定量则试管中的溶液夜色保持红色不变。以此使胶体金红色不变而抗体含量最少的 管作为稳定lml胶体金所需要的蛋白量。在此基础上再加50%的蛋白量即本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肾综合征出血热诊断试纸条，该试纸条是在ＰＶＣ底板（７）上顺次相互搭接地粘贴样品吸收垫（１）、胶体金结合垫（２）、硝酸纤维素薄膜（５）、吸水垫（６）而形成的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，胶体金结合垫（２）由含有胶体金标记的羊抗人μ链抗体免疫金复合物的玻璃纤维素膜构成，硝酸纤维素薄膜（５）上设置有检测区（３）和质控区（４），在检测区（３）位置包被有汉坦病毒核衣壳蛋白抗原，在控制区（４）的位置包被有兔抗羊ＩｇＧ抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡丽华，王琳，熊莉娟，苏凤菊，蔡开琳，朱函坪，罗端德，揭盛华，曾令兰，肖菁，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]