本发明专利技术涉及一种分泌人干扰素α－２ｂ的重组卡介苗ｒＢＣＧ－ＩＦＮα－２ｂ及其构建方法、鉴定方法，利用基因工程技术将起分泌作用的卡介苗Ａｇ８５Ｂ信号肽片段和人ＩＦＮα－２ｂ的基因克隆至ｐＭＶ２６１，得到卡介苗穿梭表达载体ｐＭＶ２６１－Ａｇ８５Ｂ－ＩＦＮα－２ｂ，然后采用电转化技术将该载体导入ＢＣＧ中，构建重组卡介苗ｒＢＣＧ－ＩＦＮα－２ｂ，依靠ｐＭＶ２６１－Ａｇ８５Ｂ－ＩＦＮα－２ｂ在ＢＣＧ的复制和信号肽的分泌作用，能够高效分泌人ＩＦＮα－２ｂ。本发明专利技术得到的重组卡介苗ｒＢＣＧ－ＩＦＮα－２ｂ既保留了原有ＢＣＧ的免疫原性，又能持续分泌细胞因子ＩＦＮα－２ｂ，从而提高ＢＣＧ的免疫活性；ＩＦＮα－２ｂ能够直接作用于肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖和诱导分化，具有更好的抗肿瘤作用，可以减少使用剂量，降低ＢＣＧ引起的毒副作用；避免了使用外源ＩＦＮα－２ｂ所带来的应用剂量大、副作用发生率高、作用时间短暂和费用高昂的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种临床医学中的抗膀胱癌的药物，尤其是涉及一种人干扰素a -2b重组卡 介苗及其构建方法和鉴定方法。
技术介绍
膀胱移行上皮癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，手术后容易复发与进展。因此，术后需定期用丝裂霉素、阿霉素、噻替哌、卡介苗(BCG)等药物进行膀胱灌注来预防肿 瘤复发，而其中BCG是目前认为最有效的药物。但临床上，仍约有30。/。左右的患者BCG 治疗和预防效果不理想，尤其对浸润性膀胱癌疗效更低。此外，BCG膀胱灌注具有较高的 毒副作用发生率。近年来，有不少研究应用小剂量的BCG联合人干扰素a-2b(IFNa-2b) 膀胱灌注来提高抗癌疗效、降低副作用，但是联合应用的远期疗效不佳，且外源性添加IFN a-2b存在应用剂量大、副作用发生率高、作用时间短暂的问题，且费用高昂。因此，目前 有必要通过研究来改善BCG菌株，增强其抗膀胱癌作用，并减少应用剂量，降低副作用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中所存在的上述不足，而提供一种人干扰 素a _2b重组卡介苗及其构建方法、鉴定方法，能自动分泌人IFNa-2b的新型基因重组 BCG，提高抗膀胱癌作用，降低应用剂量与副作用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案是该人干扰素a-2b重组卡介苗的构建方 法，其特征在于包括以下步骤(1) 获得人IFN a -2b基因和BCG-Ag85B信号肽基因设计人IFN a -2b和BCGAg85B的扩增引物，分别从人外周血和BCG基因组中用聚合酶 联反应方法提取、扩增人IFNa-2b基因和Ag85B信号肽基因片段，并对其筛选、鉴定，其 中人IFN a -2b的上游引物5'-GACGAATTCATGTGTGATCTGCCTCAAACC-3'且含EcoR I酶切位点 下游引物5'-CGCAAGCTTTCATTCCTTACTTCTTAAAC-3'且含Hind III酶切位点，BCG-Ag85B信号肽基因的上游引物5'-GATGGATCCAATGACAGACGTGAGCCGAAAG-3'且含BamHI酶切位点 下游引物5'-GTAGAATTCCGCGCCCGCGGTTGCCGCTCC-3'且含EcoRI酶切位点；(2) 构建卡介苗穿梭表达载体利用DNA重组技术将人IFN a -2b基因和BCG-Ag85B信号肽基因片段插入质粒pMV261结核杆菌hsp60启动子下游，构建分泌型卡介苗穿梭表达载体pMV261-Ag85B-IFN a -2b并 转化大肠杆菌、抽提和纯化，对pMV261-Ag85B-IFNa-2b进行酶切、PCR扩增及DNA测序鉴 定；(3)人IFNa-2b重组BCG的构建利用电穿孔技术将已构建的重组载体 pMV261-Ag85B-IFN a -2b导入BCG，构建重组卡介苗rBCG-IFN a -2b。本专利技术所述获得人IFN a -2b基因和BCG-Ag85B信号肽基因包括以下步骤获取人IFN a-2b基因，信号肽基因BCG-Ag85B抽提、PCR扩增，所述获取人IFN a -2b基因包括人基 因组DNA提取和纯化、人IFN a-2b基因的PCR扩增、人IFN a-2b的PCR产物电泳和半定 量分析，所述信号肽基因BCG-Ag85B抽提、PCR扩增包括BCG基因组DNA抽提、BCG-Ag85B 的PCR扩增、BCG-Ag85B的PCR产物纯化。本专利技术所述构建卡介苗穿梭表达载体包括人IFN a -2b基因克隆到pMV261载体中、信 号肽基因BCG-Ag85B克隆到PMV261-IFN a -2b载体中，所述人IFN a -2b基因克隆到pMV261 载体中步骤通过人IFN a -2b DNA与pMV261分别用EcoRI和Hind III进行酶切连接，连接 产物转化E. coli细胞,挑取克隆进行酶切鉴定和测序鉴定，得到重组质粒pMV261-IFN ct -2b， 所述信号肽基因BCG-Ag85B克隆到pMV261-IFN a -2b载体中步骤将pMV261-IFN a _2b和 BCG-Ag85B分别用EcoRI和BamHI进行酶切连接，连接产物转化E. coli细胞，挑取克隆进 行酶切鉴定和测序鉴定，得到重组质粒pMV261-Ag85B-IFN a -2b。本专利技术所述人IFN a -2b重组BCG的构建包括感受态BCG的制备、电穿孔法构建重组 卡介苗与抗性筛选。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案还包括一种如上所述构建方法制得的人干 扰素a -2b重组卡介苗，其特征在于人干扰素a _2b重组卡介苗具有人IFN a _2b基因片段 和BCG-Ag85B信号肽基因片段。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案还包括一种如上所述构建方法制得的人干 扰素a-2b重组卡介苗的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤从人干扰素a -2b重组卡介苗的构建方法得到的疫苗抽取质粒DNA后，通过PCR扩增和 SDS-PAGE电泳方法得到IFN a -2b基因片段，通过Western blotting方法证实rBCG-IFN a -2b的培养上清中和菌体中有IFNa-2b蛋白的表达，采用酶联免疫吸附方法测定出 rBCG-IFN a _2b培养上清中有高水平表达的IFN a -2b。其中人干扰素a _2b重组卡介苗PCR 扩增的上游引物5'-GACGAATTCATGTGTGATCTGCCTCAAACC-3'且含EcoR I酶切位点 下游引物5'-CGCAAGCTTTCATTCCTTACTTCTTAAAC-3'且含Hind III酶切位点。本专利技术能自动分泌人IFNa-2b的新型基因重组BCG,提高抗膀胱癌作用，降低应用 剂量与副作用。 附图说明图1为本专利技术实施例重组卡介苗染色后的光学显微镜镜检结果示意图。 图2为本专利技术实施例重组卡介苗质粒DNA PCR扩增结果示意图(以IFNa -2b为引物 进行PCR扩增)。图3为本专利技术实施例重组卡介苗分泌的IFN a -2b蛋白表达Western Blotting检测示意图。图4为本专利技术实施例重组卡介苗对人外周血单核细胞(PBMC)的增殖活性示意图。 图5为本专利技术实施例不同效靶比效应细胞对T24肿瘤细胞的细胞毒活性MTT法测定示 意图。图6为本专利技术实施例不同效靶比效应细胞对T5637肿瘤细胞的细胞毒活性MTT法测定 示意图。 具体实施例方式1. 本专利技术的原理研究认为BCG发挥抗膀胱癌作用是由于BCG灌注后机体对其的免疫反应有关，而其 中细胞因子如白介素-2 (IL-2)、 Y干扰素(IFN-y)、肿瘤坏死因子a (TNF-a )等在抗癌 过程中起着重要作用。提高这些细胞因子的表达量，便可提高BCG的免疫作用和抗癌疗效。 而IFNa-2b是目前临床应用最广的细胞因子之一，广泛应用于抗肿瘤与抗病毒治疗。它不 但能够直接作用于肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖和诱导分化，同时，研究也证明IFNa-2b 与BCG联合膀胱灌注可提高局部IL-2、 IFN-Y 、 TNF-a等细胞因子的表达，从而提高BCG 的免疫活性和抗癌能力。但外源性应用IFNa-2b存在剂量大、副作用发生率高、作用时间 短暂的问题，且费用高昂。因此，如能将IFNa _2b基因重组入BCG，构建能自动表达IFNa本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人干扰素α－２ｂ重组卡介苗的构建方法，其特征在于包括以下步骤： （１）获得人ＩＦＮα－２ｂ基因和ＢＣＧ－Ａｇ８５Ｂ信号肽基因： 设计人ＩＦＮα－２ｂ和ＢＣＧＡｇ８５Ｂ的扩增引物，分别从人外周血和ＢＣＧ基因组中用聚合酶联反应方法提取、扩增人ＩＦＮα－２ｂ基因和Ａｇ８５Ｂ信号肽基因片段，并对其筛选、鉴定，其中人ＩＦＮα－２ｂ的上游引物：５′－ＧＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＡＡＣＣ－３′且含ＥｃｏＲⅠ酶切位点 下游引物：５′－ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣ－３′且含ＨｉｎｄⅢ酶切位点，ＢＣＧ－Ａｇ８５Ｂ信号肽基因的 上游引物：５′－ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＡＣＡＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＧＡＡＡＧ－３′且含ＢａｍＨＩ酶切位点 下游引物：５′－ＧＴＡＧＡＡＴＴＣＣＧＣＧＣＣＣＧＣＧＧＴＴＧＣＣＧＣＴＣＣ－３′且含ＥｃｏＲⅠ酶切位点； （２）构建卡介苗穿梭表达载体： 利用ＤＮＡ重组技术将人ＩＦＮα－２ｂ基因和ＢＣＧ－Ａｇ８５Ｂ信号肽基因片段插入质粒ｐＭＶ２６１结核杆菌ｈｓｐ６０启动子下游，构建分泌型卡介苗穿梭表达载体ｐＭＶ２６１－Ａｇ８５Ｂ－ＩＦＮα－２ｂ并转化大肠杆菌、抽提和纯化，对ｐＭＶ２６１－Ａｇ８５Ｂ－ＩＦＮα－２ｂ进行酶切、ＰＣＲ扩增及ＤＮＡ测序鉴定； （３）人ＩＦＮα－２ｂ重组ＢＣＧ的构建：利用电穿孔技术将已构建的重组载体 ｐＭＶ２６１－Ａｇ８５Ｂ－ＩＦＮα－２ｂ导入ＢＣＧ，构建重组卡介苗ｒＢＣＧ－ＩＦＮα－２ｂ。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丁国庆，沈周俊，
申请(专利权)人：丁国庆，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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