被分析物的电化学分析方法技术

一种用于电化学检测被分析物方法的感应电极，该感应电极包括一种涂有含一种被固定在其中或被吸附在其上的衔接分子的导电聚合物膜的导电电极，这些衔接分子选自抗生物素蛋白质、抗生蛋白链菌素、抗－ＦＩＴＣ抗体。通过该衔接分子与对被分析物特异性受体的结合，可将该感应电极制成对受测被分析物特异性的。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及被分析物的电化学检测方法以及该方法中所使用的感应电极。用生物传感器对生物流体中的被分析物如各种抗原、抗体、DNA分子等的电化学分析，是最有前途和吸引力的仪器分析方法之一。对该领域持续不减的兴趣和大量的出版物是由于该方法有许多基本优点，即高灵敏度、简便，以及采用相对简单而廉价的设备。本领域众所周知，生物传感器装置的设计是基于采用导电聚合物膜，如聚吡咯或聚噻吩，这种膜将与被分析物的存在相关的化学信号变成可测量的电信号(参见和)。EP-A-0193154描述了一种电化学检测使用的电极，该电极的表面被涂以聚吡咯或聚噻吩膜。与待测的被分析物互补的生物受体被吸附到聚合后的导电聚合物膜表面上。WO 8911649描述了另一种生产电化学分析中所用的聚合物电极的方法。在该方法中，含有所需结合特异性的生物受体分子在聚合期间被引入导电聚合物膜中。采用EPA-0193154和WO 89/11649中所描述的方法，对于每个给定的分析，必须合成不同的感应电极，在该电极上含有能够特异性结合欲测被分析物的固定化生物受体。PCT申请人公开的申请PCT/GB98/00548描述了一种电化学分析的电势测定方法，该方法使用的电化学感应电极包括金属电势电极又覆以包含与受测被分析物特异性结合的固定化生物受体分子的导电聚合物层。该被分析物的存在是通过被分析物结合至该固定化生物受体时，该感应电极表面电荷的变化而显示出来的。被分析物的检测是通过下列过程进行的首先安装包括感应电极和参比电极的电化学电池，将这两个电极通过浸于固定pH值的工作缓冲溶液中的测量装置相连。首先记录感应电极和参比电极之间电势差的基值，然后将感应电极和参比电极与包含被分析物、具有较高离子强度但与工作缓冲溶液相同pH值的溶液相接触，并再次记录电势差。最后将该感应电极和参比电极转至干净的工作缓冲溶液中，并再次记录电势。在恒定的pH值下，由于被分析物存在，离子强度变化引起的感应电极和参比电极之间电势差的变化与被分析物的浓度成正比。如参考文献和中所示，具有含生物受体聚合物膜的感应电极对周围溶液离子强度的阶段变化(所谓“离子阶段”步骤)的响应(电势变化的大小和比率)，在很大程度上是由聚合物膜上的电荷决定的。除构成膜的材料之外，该聚合物膜电荷是由结合于其上的受体分子的电荷决定的。如果受体电荷随其与特异性被分析物的亲合性反应而变化，由于在感应电极与测试流体接触之后进行的离子阶段步骤，感应电极的响应也发生变化。应当注意，由于大多数被分析物的两性性质，受体电荷取决于溶液的pH值，所以在离子阶段步骤中保持溶液的pH值恒定是非常重要的。因此在前述方法中，基于感应电极对该感应电极与测试流体接触前后进行的离子阶段过程响应的变化的测定，有可能确定与结合于感应电极的受体特异性结合的被分析物在测试流体中的存在。在理想的情况下，膜中受体电荷的变化以及由此感应电极响应的变化直接与结合于该感应电极的受体特异性结合的被分析物在测试流体中的浓度成正比。然而，在真实的条件下，相同被分析物的电荷能够显著地变化，产生不一致的定量结果。此外，亲合性反应并不总是伴随着受体电荷变化。这在测试小的或非荷电的抗原时经常发生。总之，以前基于使用导电聚合物电极的电化学检测方法的缺点包括复杂性，感应电极制造工艺工业化受限制，所得的感应电极特性的不一致性，无性能损失存放感应电极的能力受限制。此外，前述的电化学检测规程，特别是在PCT/GB98/00548中所述方法，限制了对小分子、非荷电的分子或其等电点接近于固定在感应电极表面上受体的等电点的分子的检测。本专利技术提供一种分析样品中，该方法很大程度上没有上述方法所固有的缺点，由于能够分析小分子和非荷电的分子，拓宽了其适用范围，提供严格的定量结果，使该电极制造工艺更适应工业生产方法，增加分析效率，改善重现性，因此提高了所得结果的可靠性。因此，本专利技术的第一方面是提供一种用于电化学检测被分析物方法的感应电极，该感应电极包括一种涂有含衔接分子的导电聚合物的导电电极，这些衔接分子选自抗生物素蛋白质、抗生蛋白链菌素、抗-FITC抗体和一种能够结合到至少一类被固定于其中的或被吸附于其上的受体分子的分子。使用感应电极的电化学分析方法所固有的主要问题之一是长时间保持固定于感应电极上受体的天然性质。该领域已经实现的相关进展仅仅是有限的酶感应电极。对大多数在文献中使用提纯受体的电化学感应电极，根本没有说明其有效的保存期限。保持固定化受体之天然性质在将抗体用作受体时特别关键，这可归因于它们固有的高度构型可变性。相反，众所周知，当将抗体及其他生物分子以浓溶液形式保存时，经过长久时间仍保持其有用的性质；所以，在使用前乃至在电化学检测过程中，可能通过受体的快速固定来解决在无损工作特性的情况下延期储存感应电极的问题。在本公开专利技术中，该问题是通过利用被固定在或被吸附至导电聚合物上的所谓衔接分子来解决的。衔接分子的作用是将对受检被分析物特异性的受体分子连接至感应电极的表面上。正如将在下面所讨论的那样，借助于使用衔接分子，有可能在感应电极生产中暂时分离工序。因此，下面方法是可行的，制造出含有被固定的/被吸附的衔接分子的电极，将其长时间储存，然后在电化学分析之前或者在电化学分析期间将特异性受体固定在该电极上。选择适当的衔接分子，也可能制造包含能够结合整个系列不同受体分子的衔接分子的通用感应电极。仅仅通过将适当特异性的受体结合到衔接分子上，就可在赋予“通用的”感应电极对受测被分析物的特异性。所以在电沉积过程中，不再需要引入所需的特异性的受体。抗生物素蛋白和抗生蛋白链菌素优选用作衔接分子。抗生物素蛋白质，一种从生鸡蛋中获得的蛋白质，是由四种同样的肽亚单位组成，其中每一种都具有一个能够与辅助因子生物素分子结合的位点。生物素(维生素H)是一种存在每种活细胞中的极微量辅酶，并被发现主要结合在蛋白质或多肽上。生物素分子进入与抗生物素蛋白质或抗生蛋白链菌素(从某些细菌温育物(例如链霉菌属aviation)中分离的一种抗生物素蛋白质)的结合反应，并在该反应期间形成事实上非解离的“生物素-抗生物素蛋白质”(络合物常数约10-15mol/l)的能力是众所周知的。由本公开专利技术的专利技术人进行的调查表明，被固定在导电聚合物膜中抗生物素蛋白质和抗生蛋白链菌素在延长的时间内保持其原来的天然性质(至少一年并可能更长)，并在此期间一直能够用于与生物素缀合受体连接。生物素与许多不同分子缀合的技术在本领域是众所周知的。因此，仅仅通过结合适当的生物素化的受体，就能够制造出对给定的被分析物特异性的含有固定化抗生物素蛋白质或抗生蛋白链菌素的感应电极。虽然抗生物素蛋白质和抗生蛋白链菌素是优选的衔接分子，但使用替代性衔接分子，特别是那些能够与至少一类受体分子特异性结合的分子属于在本专利技术的范畴。替代性衔接分子中包括蛋白质A、蛋白质G和外源凝集素。这些分子均可结合至少一类受体分子，即表明它们能特异性结合位于一组受体分子中每个成员的共同结合位点，其结合相互作用的离解常数为小于10-8mol/l。例如，蛋白质A(一种42kD的多肽，分离于金黄色葡萄球菌或通过DNA重组技术得到)可在Fc区域结合免疫球蛋白，特别是多种哺乳动物的IgG分子；而且蛋白质G(IgG的Ⅲ型F本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于被分析物的电化学检测方法的感应电极，该感应电极包括一种涂有含衔接分子的导电聚合物层的导电电极，这些衔接分子选自抗生物素蛋白质、抗生蛋白链菌素、抗－ＦＩＴＣ抗体和一种能够特异性结合在至少一类被固定在其中或被吸附在其上的受体分子上的分子。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：DA法马科夫斯基，YY米拉诺夫斯基，VR彻尔卡索夫，YS比尔于科夫，O莱奥纳多瓦，
申请(专利权)人：传感技术有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]