抗钩端螺旋体的单克隆抗体及钩端螺旋体的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种抗钩端螺旋体的单克隆抗体及钩端螺旋体的检测方法。５６６０１－ＭＡｂ对钩体黄疸出血群赖型有特异性免疫反应，５６６０２－ＭＡｂ对钩体爪哇型有特异性免疫反应，５６６０６－ＭＡｂ对钩体秋季型有特异性免疫反应，５６６０９－ＭＡｂ对钩体流感伤寒群临６型有特异性免疫反应，５６６１０－ＭＡｂ对钩体七日热型有特异性免疫反应，而５种单克隆抗体均与其他血清型的钩体没有免疫反应。本发明专利技术提供的抗５种致病血清型钩体的５种单克隆抗体，对准确、快速分型、抗原的纯化及用于临床病人与动物钩体病的诊断均具有重要意义。本发明专利技术提供的以单抗为基础的ＴＡＳ－ＥＬＩＳＡ检测诊断方法具有快速、方便、灵敏正确、特异性好、结果可肉眼观察等优点，有利于其的推广应用。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种。
技术介绍
钩端螺旋体病是一种严重的自然疫源性急性传染病。世界各大洲均有流行，我国已有26个省、市、自治区发现病人或病畜及带菌动物，已查出的带菌动物有50多种，约有58％的县有本病流行。该病多发生于夏秋季节，病势急剧，感染方式和临床表现具有复杂性，临床分型包括黄疸出血型、脑膜脑炎型、肺出血型、肾功能衰竭型和流感伤寒型。该病原不仅使人患病，对家畜的危害也很大，是一种典型的人畜共患的传染病。钩端螺旋体病的病原为钩端螺旋体，简称钩体，该病原属钩端螺旋体属，该属分二种，一种为问号钩端螺旋体，包括所有的寄生性和致病性血清型；另一种为双曲钩端螺旋体，包括所有腐生性血清型。迄今钩体的分类仍然主要以血清学反应为准，但这一血清学方法的准确性尚不理想、在已经检定的血清型中存在着许多差异，主要问题之一是在不同的实验室抗血清的制作方法缺乏标准化。而且现在的分类技术尚不能分辨出病原体在流行病学上的关键性的差别。钩端螺旋体从形态、和常规血清学方法很难正确判断钩体是否为致病病原，从而为该病原的检测诊断带来困难，虽然经过几十年的努力，在钩端螺旋体病的科研和防治方面已取得了一些成就，目前钩体诊断方法主要有直接暗视野显微镜检查法、改良镀银染色法、以多抗血清为基础的免疫荧光检查法、间接血凝试验、反向被动血凝试验、凝集试验及凝集素吸收试验、膨胀试验、酶联免疫吸附试验等，但有关本病的流行预测，传染源的消灭，家畜带菌的排除，早期的快速诊断方法等都有待进一步的探索，而单克隆抗体是有一个抗体产生细胞与一个骨髓瘤细胞融合而产生的杂交瘤细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类别，质地纯一，而且因为它是针对单一抗原决定簇的，因此特异性强，亲和性也一致。制备针对不同致病钩体的不同单克隆抗体，并用单抗组成特异性的钩体检测方法，有利于致病钩体的分型和正确诊断，为该病的防治打下坚实的基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种。抗钩端螺旋体的单克隆抗体是，5660 1-MAb对钩体黄疸出血群赖型有特异性免疫反应，而与其它血清型的钩体没有免疫反应；56602-MAb对钩体爪哇型有特异性免疫反应，而与其他血清型的钩体没有免疫反应；56606-MAb对钩体秋季型有特异性免疫反应，而与其他血清型的钩体没有免疫反应；56609-MAb对钩体流感伤寒群临6型有特异性免疫反应，而与其他血清型的钩体没有免疫反应；56610-MAb对钩体七日热型有特异性免疫反应，而与其他血清型的钩体没有免疫反应。检测5种致病血清型钩端螺旋体的TAS-ELISA方法的步骤为1)抗钩体的兔抗血清100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，过夜；2)PBST洗涤三次后加1-10％的脱脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封闭200ul/孔于37℃封闭30-60min；3)加入检测样品100ul/孔。以标准血清型钩体为阳性对照，以相应的健康样品作阴性对照，37℃1-2h；4)洗涤后加用封闭液稀释的单抗腹水100ul/孔，37℃1-2h；5)PBST洗涤后加入10000倍稀释HRP标记兔抗鼠IgG二抗结合物(Sigma)100ul/孔，37℃1-2h；6)PBST洗涤后加OPD-H2O2底物于室温显色5-30min，2mol/L H2SO4终止反应后，肉眼观察底物颜色变成橙黄色的孔为阳性或用550型酶联免疫检测仪测492nm的OD值，以P/N＞2.1作为阳性判断标准。由于钩端螺旋体的抗原结构复杂，血清型又多，用常规以多抗血清为基础的血清学方法分型复杂繁琐，不利于本病的早期快速诊断，用杂交瘤技术所产生的抗钩体的单克隆抗体，能特异、快速地对钩体血清型进行鉴定。因此本专利技术提供的抗5种致病血清型钩体的5种单克隆抗体，对准确、快速分型、抗原的纯化及用于临床病人与动物钩体病的诊断均具有重要意义。本专利技术还提供一种可特异检测5种致病血清型钩体的灵敏、快速正确的诊断检测方法，即TAS-ELISA检测方法。目前钩体诊断方法虽然均取得了一定的效果，但这些方法均有不足之处，有的阳性检出率不高，灵敏度低；有的操作技术复杂；有的需一定设备条件；有的判断结果需有一定经验，并受菌量、时间因素的限制；有的特异性不高，假阳性率高，结果不正确，且多数方法费时费力。而本专利技术提供的以单抗为基础的TAS-ELISA检测诊断方法具有快速、方便、灵敏正确、特异性好、结果可肉眼观察等优点，有利于其的推广应用。具体实施例方式钩端螺旋体是一种重要的人畜共患的病原菌。在自然界人和50多种动物都为其宿主或寄主，是严重危害人畜安全的自然疫源病原之一。目前钩体病总体发病率及死亡率均已显著下降，但许多地区流行因素依然存在，稍有疏忽，就可能引起该病爆发流行。目前致病钩体分型和检测诊断的常规方法均存在不足之处，而单抗具有特异性、均质性、稳定性、能大量生产、能正确分型和检测等优点，因此开展致病钩体的单抗和以单抗为中心组合成正确、快速的检测方法研究具有重要意义。本专利技术制备分别抗5种致病血清型钩体的5种单抗及相应的检测诊断方法。我们用灭活的这5种血清型钩体制备出抗相应血清型钩体的单抗，并建立了相应正确、灵敏、快速、方便的TAS-ELISA方法，从而为钩体病的防治打下基础。一.克隆抗体的制备1.免疫原的制备钩体黄疸出血群赖型菌株、爪哇型菌株、秋季型菌株、流感伤寒群临6型菌株、七日热型菌株的活钩体在8％兔血清改良Korthof培养基30℃培养3-4周，将这些培养物经2％甲醛溶液灭活48小时，12000rpm离心10分钟。沉淀用灭菌0.01mol/L PBS pH7.2离心洗涤三次，最后用少量灭菌PBS溶解沉淀备用。2.免疫动物选择体重18-20g BALB/C雌性小鼠，分别用钩体赖型、爪哇型、秋季型、临6型、七日热型菌的制备抗原免疫。在400倍暗视野下镜检，将每视野达100个菌体的以上者各取1ml与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.5ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次皮下多点注射0.5ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。3.细胞融合取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-10∶1的比例，在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用分子量为3350的50％PEG(Sigma)作为融合剂，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5％CO2的细胞培养器皿中培养。4.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10％-50％时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获50多个对上述5种血清型钩体有反应的阳性孔。5.阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆阳性孔的特异性鉴定采用间接ELISA方法，具体为福尔马林灭活的用包被液稀释成1-30ug/mL的不同血清型钩体50ul/孔包被ELISA板，37℃过夜，使其全部干燥后，吸附于聚苯乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗钩端螺旋体的单克隆抗体，其特征是，５６６０１－ＭＡｂ对钩体黄疸出血群赖型有特异性免疫反应，而与其它血清型的钩体没有免疫反应；５６６０２－ＭＡｂ对钩体爪哇型有特异性免疫反应，而与其他血清型的钩体没有免疫反应；５６６０６－ＭＡｂ对钩体秋季型有特异性免疫反应，而与其他血清型的钩体没有免疫反应；５６６０９－ＭＡｂ对钩体流感伤寒群临６型有特异性免疫反应，而与其他血清型的钩体没有免疫反应；５６６１０－ＭＡｂ对钩体七日热型有特异性免疫反应，而与其他血清型的钩体没有免疫反应。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，陈正贤，李桂新，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]