偶联酶促反应测定5'-核苷酸酶的方法和试剂盒技术

技术编号:2589097 阅读:254 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
Bertrand(1982)借助5’-核苷酸酶将次黄苷酸水解产生次黄苷,通过次黄苷偶联嘌呤核苷磷酸化酶和黄嘌呤氧化酶酶促反应生成过氧化氢,利用Trinder氏反应过氧化氢在过氧化物酶的氧化作用下将供氢体3,5-双氯-2-羟基苯磺酸和4-氨基比林偶联物凝聚成紫红色的有色醌,通过连续反应和动态观察有色醌510nm处吸光度上升的速率来测定5’-核苷酸酶的活性。该法缺点是供氢体的选择过窄。本发明专利技术将苯胺类化合物ADOS、ADPS、ALPS、TODB、TOOS和TOPS用作Trinder氏反应的供氢体,增加了反应的灵活性。本发明专利技术还涉及用于进行上述方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物样本中测定5’-核苷酸酶活性的技术方案以及有此方案制造的试剂。特别是涉及一种有5’-核苷酸酶将次黄苷酸水解产生次黄苷后偶联多酶促反应体系。
技术介绍
Bertrand(1982)借助5’-核苷酸酶(5’-Nucleotidase,5’-NT)将次黄苷酸(Inosine5’-monophosphate disodium salt,IMP)水解产生次黄苷(Inosine)。通过次黄苷偶联嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleoside phosphorylase,PNP)和黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase,XOD)酶促反应生成过氧化氢(H2O2)。利用Trinder氏反应(1969)H2O2在过氧化物酶(Peroxidase,POD)的氧化作用下将3,5-双氯-2-羟基苯磺酸(3,5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonicacid,DHBS)和4-氨基比林(4-aminophenazone)偶联物凝聚成紫红色的有色醌(Quinoneiminedye)。通过连续反应和动态观察有色醌510nm处吸光度上升的速率来测定5’-NT的活性。该法缺点是供氢体的选择过窄,仅选用DHBS。其反应原理和参考文献如下 Alain Bertrand and Jean Buret,用离心生化分析仪一步测定血清5’-核苷酸酶。临床化学学报119(1982)275-284。P.Trinder,用葡萄糖氧化酶和一种新型氧受体来测定血糖。临床生化年刊,卷6,24-26页,1969。
技术实现思路
Bertrand氏测定5’-NT的次黄苷偶联酶促反应体系仅选用DHBS作为供氢体,不利于反应的灵活应用。本专利技术对Bertrand氏法中Trinder氏反应进行了改进。将以下任一苯胺类化合物用作Trinder氏反应的供氢体。从而增加了反应的灵活性,使5’-NT测定的整套反应体系更有利于临床推广使用。1)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-3-甲氧基苯胺2)N-乙基-N-(3-硫丙基)-3-甲氧基苯胺3)N-乙基-N-(3-硫丙基)苯胺4)N,N-双(4-硫丁基)-3-甲基苯胺5)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-3-甲基苯胺6)N-乙基-N-(3-硫丙基)-3-甲基苯胺本专利技术借助5’-NT水解次黄苷酸生成次黄苷。通过次黄苷偶联PNP和XOD酶促反应,使产生的H2O2在POD的氧化作用下将苯胺类供氢体和4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine,4-AA)偶联物凝聚成有色产物。通过连续反应和动态观察有色产物的产量,从而测定5’-NT的活性。以本专利技术的次黄苷偶联酶促反应配制了测定5’-NT的试剂盒。具体实施例方式1.确定IMP Michaelis常数Km1)试剂组成试剂IGood’s缓冲液pH 7.6 100mmol/L4-AA 2mmol/L5’-NT 150U/L(响尾蛇毒)PNP 100U/LXOD 200U/LPOD 600U/L试剂II Good’s缓冲液pH 7.6 100mmol/LIMP 0.001-10mmol/LTOOS 2mmol/L2)试验参数与操作步骤温度 37℃ 波长550nm比色杯光径 1.0cm测试方法速率法反应方向正予孵育 1.8ml试剂I予孵育时间 5分钟启动反应加0.9ml试剂II延迟时间2分钟测试时间3分钟测试仪 Shimadzu UV-1603)计算计算出测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)。ΔA/min=(ΔA1/min+ΔA2/min+ΔA3/min)3]]>4)结果以ΔA/min作为反应速率V,用1/V作为Y轴,IMP浓度S的倒数1/S作为X轴。作Lineweaver-Burke图。求得IMP Km 3×10-5mol/L。2.确定有色产物毫摩尔消光系数ε1)试剂组成试剂IGood’s缓冲液pH7.6 100mmol/L4-AA 2mmol/L5’-NT 150U/L(响尾蛇毒)PNP 100U/LXOD 200U/LPOD 600U/L试剂II Good’s缓冲液pH7.6 100mmol/LIMP 3mmol/LADOS或ADPS或ALPS 2mmol/L或TODB或TOPS或TOOS2)试验参数与操作步骤温度37℃波长260nm(IMP)比色杯光径 1.0cm测试方法速率法反应方向负予孵育 1.8ml试剂I予孵育时间 5分钟启动反应加0.9ml试剂II延迟时间2.5小时测试仪 Shimadzu UV-160 动态观察1mmol/L IMP吸光度下降至2.5小时后完全降解。然后,在以下波长测定有色产物的吸光度542nm (ADOS)540nm (ADPS)561nm (ALPS)630nm (TODB)630nm (TOPS)550nm (TOOS)3)结果ε毫摩尔消光系数 在本法条件下供氢体ADOS氧化凝聚产物ε=64.46mM-1cm-1ADPS氧化凝聚产物ε=66.12mM-1cm-1ALPS氧化凝聚产物ε=97.88mM-1cm-1TODB氧化凝聚产物ε=53.32mM-1cm-1TOPS氧化凝聚产物ε=53.32mM-1cm-1TOOS氧化凝聚产物ε=76.07mM-1cm-13.苯胺类供氢体化合物的选择1)试剂组成试剂I Good’s缓冲液pH7.6 100mmol/L4-AA 2mmol/LPNP100U/LXOD200U/LPOD600U/L试剂II Good’s缓冲液pH7.6 100mmol/LIMP10mmol/LADOS或ADPS或ALPS 2mmol/L或TODB或TOPS或TOOS2)生物样本O-300U/L响尾蛇毒5’-NT3)试验参数与操作步骤温度37℃波长542nm (ADOS)540nm (ADPS)561nm (ALPS)630nm (TODB)630nm (TOPS)550nm (TOOS)比色杯光径 1.0cm测试方法速率法反应方向正予孵育 0.05ml样本+1.8ml试剂I予孵育时间 5分钟启动反应加0.9ml试剂II延迟时间2分钟测试时间3分钟测试仪 Shimadzu UV-1604)计算计算出测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)。ΔA/min=(ΔA1/min+ΔA2/min+ΔA3/min)3]]>5,-NT(U/L)=ΔA/min×Tv×1000ϵ×Sv×L]]>一个5’-NT活性单位(U/L)定义为在本测试特定条件下每分钟将1μmole次黄苷酸水解成为次黄苷。ε毫摩尔消光系数 在本法条件下供氢体ADOS氧化凝聚产物ε=64.46mM-1cm-1ADPS氧化凝聚产物ε=66.12mM-1cm-1ALPS氧化凝聚产物ε=97本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定生物样本中5’-核苷酸酶活性的方法,其特征是借助5’-核苷酸酶将次黄苷酸水解产生次黄苷,通过次黄苷偶联嘌呤核苷磷酸化酶和黄嘌呤氧化酶酶促反应生成过氧化氢,过氧化氢在过氧化物酶的作用下使苯胺类供氢体和4-氨基安替比林偶联物凝聚成有色产物,通过连续反应和动态观察有色产物的产量,从而测定5’-核苷酸酶的活性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:蔡枫
申请(专利权)人:浙江亚克药业有限公司蔡枫
类型:发明
国别省市:86[中国|杭州]

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