使用微球体检测和多重定量样品中分析物的方法技术

本发明专利技术涉及使用功能化的微球体检测和多重定量样品中分析物的方法，其中所述微球体是在与样品接触后磁化的。本发明专利技术的方法尤其适于通过流式细胞计量术来检测和多重定量数种分析物。本发明专利技术还涉及为了进行本发明专利技术的方法，用于检测和／或定量数种分析物的试剂盒，该试剂盒包括功能化非磁性微球体的悬浮液、铁磁流体和至少一种缀合物的溶液。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用功能化微球体检测和/或多重定量样品中分析物的方法，在样品和这些微球体接触的步骤后，将这些微球体磁化。本专利技术的方法尤其适于通过流式细胞计量术来检测和多重定量数种分析物。本专利技术还涉及用于检测和/或定量数种分析物的试剂盒，以便实现根据本专利技术的方法，该试剂盒包括功能化非磁性微球体的悬浮液，铁磁流体的溶液和至少一种缀合物的溶液。
技术介绍
体外诊断的发展和多样化日益需要建立快速检测和鉴定各种化合物和微生物的方法。这同时需要涉及人或动物健康部门，例如来找寻或测试特定抗原或病原体，农业食品部门，例如质量控制和筛选打算作为食品的产品中可能的污染物，或环境部门，当包括时，例如，预防任何生物风险或检测杂质、杀虫剂或各种污染物质。微珠上的免疫测定结合流式细胞仪型分析系统的使用构成最适于这些需要的技术途径之一，且在本领域的评述中已经提出了许多基于该原理的方法。例如，公开号为WO 98/51435，WO 94/09368和WO 90/15666的国际专利申请，和公开号为EP 180384的欧洲专利申请，描述了可以用于诊断方法中的特定类型的磁性或荧光颗粒。现有技术的其它文件提出了用于鉴定和/或测定磁珠上的多重分析物的各种实验方案。因此，例如，公开号为WO 90/05305的国际申请，涉及通过使用数个亚群荧光珠的凝集方法来检测和/或测定样品中数种分析物的方法及其相应的试剂盒。通过流式细胞仪、成像分析或激光扫描系统可以测量所形成凝集物的荧光。授权号为US 4,665,020的美国专利涉及通过流式细胞仪使用两群不同直径的球体来测定抗原的方法，最大的涂覆抗原特异性抗体，最小的是荧光的。根据三明治方法的原理或根据连接荧光球体的配体(抗体或抗原)的竞争方法进行测定。公开号为WO 97/14028的国际申请涉及通过流式细胞仪检测数种所关心分析物的分析方法，其中该使用包括多个亚群的珠子，其中至少一个分类参数可以通过流式细胞仪来分析，从而使一个亚群与另一个亚群区分开来。每个亚群连接与一种待测定分析物特异性反应的化合物。通过细胞计量术，通过分析每个亚群的所有分类参数，来鉴定珠子的亚群，并因此鉴定与相应分析物反应的化合物的性质。公开号为WO 98/20351的国际申请涉及测定样品中一种或多种分析物存在的方法，其中使用包括“测试”群微粒，每个群携带分析物特异性配体，且参照微粒不与任何待研究的分析物反应。通过计数每个“测试”群中的游离微粒的数量并将其与参照微粒的数量相比较来进行该测定。根据各种方法来进行计数，优选包括细胞计量术。公开号为WO 96/31777的国际申请涉及检测样品中微生物的方法，使用至少一种携带待研究微生物特异性配体的可检测颗粒。然后使用携带荧光标记的第二种配体来显示连接颗粒的微生物。授权号为US 6,280,618的美国专利涉及单个检测多个分析物的方法，其中使用包括磁微粒群的混合，该磁性颗粒可以相互区分开来，且每种携带不同的配体。从介质中分离每组微粒，然后悬浮于第二种液体介质中，其中通过流式细胞计量术来分析。公开号为WO 93/02260的国际申请涉及流式细胞计量术同时检测相同样品中数种分析物的方法，以及实施该方法的试剂。该试剂由数个亚群的微球体构成，每个亚群表面携带能够于待检测的一种分析物形成特异性结合对的特异性抗体。在加入携带荧光染料的能够结合所形成的结合对试剂后，进行连接微球体的分析物的检测。同时检测相同样品中数种分析物的方法还包括一个或多个磁分离步骤。实际上，这样的磁分离步骤可能有助于特定复杂培养基中的测定，其中所关心的抗原必需特异性分离(可以使用细胞计量分析来检验在特定微粒存在下不可能进行的)。例如，这是用于分析农业食品、造纸和废水处理中的情况，其中研究各种液化的磨碎材料中的分子/颗粒(果肉、葡萄汁、乳制品乃至干酪、果汁、磨碎的蔬菜原料、发酵酒等)，由于失去待测定分析物的风险，其制备物不能过滤。这还可以是用于分析环境和人健康科学的情况，其中通过生物取样器将大体积空气的颗粒内容物浓缩于液体中。在这种情况下，还必须除去空气悬浮液中的所有颗粒、灰尘、微纤维、花粉等，其的大小i)覆盖捕获珠子(1至30μm)且使其仅通过光散射参数难以或甚至不可能鉴定，ii)或通过阻塞细胞计量仪使得分析矛盾(从100μm开始为高风险)，并在生物收集后发现其在液体中浓缩。此外，还必需除去与细胞计量仪流控的校正功能不相容的油质(油性)颗粒。此外，使用磁分离还使得可以快速浓缩待测定的试剂并避免了必须使用离心步骤来洗涤捕获珠子。磁珠特异性捕获步骤和磁分离步骤这样的结合已经描述于现有技术中，尤其是授权号为US 6,280,618的专利中。然而，在鉴定和分析样品中含有的分析物的方法中使用磁性微球体存在各种工业局限，并妨碍了操作和悬浮液取样的均一性。这是因为不同大小(且通常具有不同含量的可磁化材料)的磁性微球体在磁分离过程中可以具有不同的行为，即，较长或较短的磁化时间。根据存在的磁珠族从其产生了可变的分离产量，因此产生了结果的不均一性或延长磁性分离阶段。为了克服这个问题，需要根据大小调节磁性微球体的可磁化材料含量。就制造或供应而言，这当然产生了工业极限。此外，磁性微球体是致密的，其在储存中存在沉淀和在重悬浮和快速沉淀分析过程中具有沉淀的实际问题。实际上，磁珠的密度通常大于1.15，且根据磁铁的量，在1.15至1.50之间变化，导致非常快的沉淀率，尤其是对于较大直径的颗粒(＞2μm)(比较公开号为EP1248110的欧洲专利申请)。因此，目前需要发展新的特异性方法来鉴定和测定液体样品中所含有的数种分析物，且该方法包括一个或多个磁分离步骤，所述方法能够避免与使用磁性微球体相关的缺陷。美国专利US 5,998,224(1999年12月7日公开，申请者AbbottLaboratories)的主题是检测测试样品中分析物的存在或含量的方法。根据第一个实施方案，该方法包括使测试样品与移动固相和磁性试剂接触，以致形成反应混合物，其中所述分析物结合所述移动固相和所述磁性试剂，使得形成复合物，然后运用磁场。根据第二个实施方案，该方法包括使分析物和磁性试剂接触来形成第一种复合物，并使磁性试剂接触移动固相来形成第二种复合物，然后运用磁场。根据该第二个实施方案的可替换实施方案，分析物结合移动相来形成第一种复合物，磁性试剂结合移动相来形成第二种复合物，然后运用磁场。2001年12月27日公开的公开号为US 2001/0054580的美国专利申请(Bio-Rad Laboratories，Inc，与EP 1248110相关)的主题是区分样品中数种分析物的多重测试。该测试使用磁性颗粒作为固相并使每个分析物产生单独的结果。通过可以以组区分的特征将磁性颗粒相互区分开来，每组携带与颗粒表面结合的试剂，该试剂不同于存在于其它组颗粒上的试剂。该多重测试中，使含有所述分析物的样品接触磁性颗粒。1987年8月5日公开的公开号为EP 230768的欧洲专利申请(Syntex Inc)的主题是从液体介质中分离物质的方法。该方法使用磁性或非磁性颗粒。可以将该非磁性颗粒功能化来结合特异性结合对的成分，或结合磁性颗粒。被描述铁磁流体为磁性流体，其中悬浮液中的颗粒是铁磁颗粒。磁性流体的胶体磁本文档来自技高网...

【技术保护点】
使用功能化的非磁性微球体检测和／或多重定量样品中含有的分析物的方法，其中适当地可以用标记预先对所述分析物进行标记，所述方法的特征在于包括以下步骤：ａ）使所述样品接触功能化非磁性微球体群的悬浮液，所述微球体在其表面携带；－对于 所有的微球体群，形成结合对第一种成分的化合物Ａ，所述化合物Ａ的特征还在于不与所述分析物结合；－对于每种微球体群，对每群不同的化合物Ｂ，能够与样品中所述分析物中的一种形成特异性结合对，ｂ）将铁磁流体加入步骤ａ）中所获得的反应介 质中，该铁磁流体含有在其表面携带能够与化合物Ａ形成特异性结合对的第二种结合成分的磁性颗粒，ｃ）至少一个通过步骤ｂ）中磁化微球体磁分离的洗涤步骤，ｄ）其中适当的，当所述分析物预先没有标记时，使步骤ｃ）中所获得的磁化微球体悬浮液 接触至少一种缀合物的溶液，所述缀合物包括能够识别和特异性结合一种所述分析物和标记的化合物Ｃ，该步骤ｄ）优选接着至少一个通过磁分离洗涤微球体的步骤，ｅ）检测和／或定量微球体表面的所述标记。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：G阿凯特，P蓬斯莱，M穆拉尔，M康东，
申请(专利权)人：佰赛泰克斯公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]