一种测定非小细胞肺癌血浆蛋白质指纹图谱的方法技术

本发明专利技术属生物技术领域，涉及一种测定非小细胞肺癌血浆蛋白质指纹图谱的方法。本方法采用表面增强激光解析离子化－飞行时间质谱测定技术进行肺癌的特异性蛋白峰比较识别，对经查体各项指标正常，且血脂、血糖、肝肾功能，乙肝五项化验均正常的健康人，和经病理检验证实为肺癌病人或非小细胞肺癌病人或肺部疾患的血浆进行测定，结果表明，在非小细胞肺癌患者的血浆蛋白质指纹图谱中显示有判别意义的蛋白质峰，其准确率对肺癌而言为９３．７５％，正常人为９３．９３％。本方法能进一步为筛查肺癌，尤其是非小细胞肺癌病人提供简易的、特异性技术手段。也适用于大规模人群如体检、流行病学调查等，还可用于对临床患者的判别。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，涉及血浆蛋白质指纹图谱，具体涉及。
技术介绍
蛋白质指纹图谱技术有蛋白芯片技术和质谱鉴定技术组成，而后者有分为基质辅助的激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)，近来有研究发展了表面增强的激光解析离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)可直接应用血浆等体液样本，具有需要样本量少(如血浆0.5ul-500ul，细胞约2000个)，可检测低丰度(1fmol)、低分子量的未知蛋白，由于以上特点，比较适合临床应用。SELDI-TOF-MS技术目前已广泛应用于肿瘤、新药开发、传染病、神经、精神疾病等领域。已有研究报道，关于肿瘤诊断的研究结果于2002年Lancet上由美国FDA和NCI合作研究的卵巢癌的早期诊断上(Lancet 2002，359(2)590-7)，与传统的CA125单项指标相比(阳性预测值仅35％)，仅蛋白质指纹图谱的多项指标诊断模型的敏感度在100％，阳性预测值高达94％，以后的几年中，该方法已用于如小细胞肺癌(Lancet 2003，362(9382)433-9)、前列腺癌(J Urol2004，172(4pt)1302-5)、肾癌(Int J Mol Med 2005。15(2)285-90)、乳腺癌(Breast Cancer Res Treat2004，86(3)281-91)、头颈部肿瘤(Clin Cancer Res2004，10(14)4806-12)国内已开展此项技术，如上海华山医院用于膀胱癌(Clin Biochem 2004，37(9)772-9)和神经胶质瘤研究；瑞金医院用于胰腺癌和血液病研究，中山医院用于慢性肝病，包括肝炎、肝硬化和肝癌及其转移复发的研究；浙江大学用于结肠癌(Clin Cancer Res 2004，10(14)8380-5)等。展现了广阔的临床应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种测定非小细胞肺癌的血浆蛋白质指纹图谱的方法。具体涉及血浆蛋白质的表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱测定和肺癌的特异性蛋白峰比较识别的方法。本方法可用于提高鉴别肺癌尤其是非小细胞肺癌的特异性。本专利技术方法的主要技术方案是采用表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术，包括患者血浆样本的采集标准，化学芯片的选择、处理和阅读，测定条件的优化；判别模式及验证。本方法对经查体各项指标正常，且血脂、血糖、肝肾功能，乙肝五项化验均正常的健康人血浆进行测定，和经病理检验证实为肺癌病人或非小细胞肺癌病人或肺部疾患(包括支气管扩张、肺炎、肺梗塞)的血浆进行测定，结果表明，在非小细胞肺癌患者的血浆蛋白质指纹图谱中显示有判别意义的蛋白质峰，其准确率对肺癌而言为93.75％(30/32)，正常人为93.93％(31/33)。本方法能进一步为筛查肺癌，尤其是非小细胞肺癌病人提供简易的、特异性技术手段。也适用于大规模人群如体检、流行病学调查等，还可用于对临床患者的判别。表1是筛查非小细胞肺癌病人的血浆蛋白质指纹图谱总结表。表1 附图说明图1是同一样品同一芯片血浆样品检测重复性分析图(WCX芯片/SELDI-TOF/MS)，其中显示，强度重复性CV＝16.81％，分子量重复性CV＝0.0233％。图2是同一样品不同芯片血浆样品检测重复性分析图(WCX芯片/SELDI-TOF/MS)，其中显示，强度重复性CV＝17.74％，分子量重复性CV＝0.0237％。图3是血浆蛋白质指纹图谱中有判别意义的蛋白质峰蛋白质峰1M/Z 3944；蛋白质峰2M/Z 2826，其中，第1、2行NSCLC病人；第3、4行正常人血浆。图4是区分正常人和非小细胞肺癌病人的血浆蛋白质图谱的判别模式(决策树模型)。具体实施例方式实施例1表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)实验1.标本收集及预处理标本来源正常健康人血浆由上海体育大学提供，查体各项指标正常，且血脂、血糖、肝肾功能，乙肝五项化验均正常，非小细胞肺癌病人血浆由上海胸科医院胸部肿瘤研究所提供，肺癌病人均经病理检验证实。标本收集空腹静脉抽血5-10ml，室温静置30分钟左右，6000rpm～1000rpm离心15分钟，收集上清(血浆)分装，-80℃保存。避免溶血和脂血标本。芯片选择比较血浆蛋白在WCX、SAX、H4、IMAC四种蛋白芯片上蛋白指纹峰的分布、表达情况，优先选择蛋白指纹峰分布和表达均理想的WCX2蛋白芯片对血浆的蛋白谱进行检测。血浆样品前处理1).从-80℃冰箱中取出血浆样品，置冰盒上融解；2).以10000rpm，4℃离心2分钟；3).每个芯片点需要血浆3ul，将血浆用2倍体积U9缓冲液(9M urea，2％CHAPS，50mM Tris-Hcl，1％DTT，pH 9.0)稀释。稀释时，避免产生大量气泡，将样品充分混匀； 4).将以上样品冰浴振荡30分钟；5).将9ul上述变性后样品加入108ul相应的结合缓冲液，使得血浆的总稀释倍数达到约40倍，混匀，避免气泡产生；6).将处理好的血浆样品上样到芯片上。2.实验操作1)取出WCX2的芯片，在芯片背后标记时间，芯片种类等资料；2).将芯片装入生物芯片处理器(Bioprocessor)，在组装生物芯片处理器时，不触碰加样孔，同时将芯片上带有”A”的一头放在外端，注意密封；3).每孔加入200ul结合缓冲液(50mM NaAC，pH 4.0，或试剂盒中的binding buffer)，置振荡器(MS1 Minishaker)400-600转/分震荡5分钟，甩掉缓冲液。重复上述操作。保持芯片上每点的湿润，加缓冲液后保持芯片无气泡，枪头不接触芯片上各点表面；4).上样(剂量根据实际需要而定)，在芯片处理器每孔中加入100ul处理好的样品，置振荡器(MS1 Minishaker)400-600转/分，4℃震荡1小时；5).甩出样品，其中生物样品(如血液，尿样，脑脊液，癌细胞液等)甩入预装消毒剂的容器；6).每孔加入200ul的结合缓冲液(50mM NaAc，pH 4.0或试剂盒中的binding buffer)，室温置振荡器(MS1 Minishaker)400-600转/分震荡5分钟，甩去孔中液体，再加入结合缓冲液200ul，重复操作；7).每孔加入200ul HPLC水，甩出；8).拆开芯片处理器，取出芯片，待干后，每个加样孔上加SPA 0.5ul，待干后，重复加SPA 0.5ul一次；9).待干后，即可上机测定。3.设置芯片阅读参数1)设定最高质量5000道尔顿，最适范围2000-20000道尔顿； 2)设定初始激光强度为185；3)设定检测敏感度为8；4)校正聚焦点于孔中央；5)设定质量检测器为1000道尔顿；6)设置数据处理为SELDI位置；7)设定SELDI参数为22delta至4转换，终点为82；8)设定湿热位置至2，强度为10；9)置入样品。4，血清样品检测重复性分析(SELDI-TOF-MS/WCX2蛋白芯片)，同一样品同一芯片重复性分析结果表明，强度重复性CV＝16.81％，分子量重复性CV＝0.0233％；同一样品不同芯片重复性分析结果表明，强度重本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定非小细胞肺癌血浆蛋白质指纹图谱的方法，其特征是采用表面增强激光解吸／电离飞行时间质谱（ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）技术，包括非小细胞肺癌血浆样本的采集标准，化学芯片的选择、处理和阅读，测定条件的优化；判别模式及验证，所述的芯片阅读参数设置为：１）设定质量范围２０００－２００００道尔顿；２）设定初始激光强度为１８５；３）设定检测敏感度为８；４）校正聚焦点于孔中央；５）设定质量检测器为１０００道尔顿；６）设置数据处理为ＳＥＬＤ Ｉ位置；７）设定ＳＥＬＤＩ参数为２２ｄｅｌｔａ至４转换，终点为８２；８）设定湿热位置至２，强度为１０。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：冯久贤，沙慧芳，
申请(专利权)人：上海市胸科医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]