本发明专利技术提供了一种抗心肌抗体四联诊断试剂盒，包括包被有与四种心肌抗原有相同抗原原性的人工合成的抗原多肽的包被反应板、辣根过氧化物酶标记的羊抗人ＩｇＧ酶标二抗、样品稀释液、浓缩洗液、显色剂Ａ、显色剂Ｂ、阴性对照血清、终止液和说明书，本发明专利技术试剂盒对病毒性心肌炎和扩张型心肌病有较高的敏感性和较强的特异性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医用检测试剂盒，特别是心肌抗体检测试剂盒。
技术介绍
病毒性心脏病(VHD)是一组与病毒感染有关的心脏疾病，常见的有病毒性心肌炎(VMC)和扩张型心肌病(DCM)。近年来，VHD的发病率有逐渐增高的趋势。在病毒感染的流行期约有5％的患者发生心肌炎，其中12.5％可转化为DCM，而普通人群中DCM发病率仅8-10/10万人口。我国广西南宁地区66632人中DCM的普查患病率为84.04/10万，占该地区各种心脏病自然发病率的第4位。一般认为，DCM患者症状出现后5年生存率约40％，10年生存率仅22％左右。目前超声心动图、胸部X线和心内膜心肌活检等检查是DCM临床诊断的常用工具。但超声心动图和胸部X线出现改变时，患者已有明显的心脏形态学改变，常伴有心力衰竭。心内膜心肌活检缺乏特异性，且难以在临床推广。故寻求对扩张型心肌病(DCM)进行早期诊断的有效方法，是本领域面临的重要课题。
技术实现思路
本专利技术的任务是提供一种抗心肌抗体四联诊断试剂盒，该试剂盒能实现对病毒性心肌炎的诊断，以及对扩张型心肌病(DCM)的早期诊断。扩张型心肌病(DCM)患者血清中存在抗心肌自身抗体，检测疑诊扩张型心肌病(DCM)患者血清中抗心肌肽类抗体，可提高DCM的诊断水平。由于天然心肌抗原分离提纯困难，难以长期保存，限制了心肌抗体检测的临床应用。本专利技术根据心肌抗原的氨基酸序列及抗原决定簇的分布状况，设计并合成多肽，并以此多肽作为抗原检测患者体内的抗心肌肽类抗体。本专利技术提供的抗心肌抗体四联诊断试剂盒的组成包括 1.包被反应板4块，每块96孔；2.样品稀释液1瓶40ml；3.浓缩洗液4瓶，每瓶50ml；4.酶标二抗1瓶40ml；5.显色剂A 4支，每支10ml；6.显色剂B 4支，每支10ml；7.阴性对照血清1支50μl；8.终止液4支，每支10ml；9.说明书1份。包被反应板为四块96孔板，四块反应板分别包被有与四种心肌抗原有相同抗原原性的人T合成的抗原多肽。样品稀释液是PH为7.4的磷酸缓冲液与小牛血清的混合液，磷酸缓冲液与小牛血清的容积比为9∶1；浓缩洗液为含0.1％Tween-20的磷酸缓冲液，其PH为7.4；酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG；显色剂A由磷酸氢二钠14.6g和柠檬酸9.33g溶于0.75％过氧化氢尿素4.6ml中，再加水至1000ml配制而成；显色剂B由四甲基联苯胺(TMB)200mg溶于无水乙醇100ml中，再加水至1000ml配制而成；阴性对照血清为健康人血清；终止液为2mol/L硫酸。试剂盒检测试剂的制备一、抗原肽的合成合成与四种心肌抗原有相同抗原原性的抗原肽。1.四种心肌抗原及合成的相应心肌细胞抗原肽段的氨基酸序列四种心肌抗原是①心肌细胞线粒体内膜ADP/ATP载体蛋白抗原(ANT)；②β1肾上腺素能受体抗原(β1)；③M2-胆碱能受体抗原(M2)； ④心肌肌球蛋白重链抗原(MHC)。合成的心肌细胞线粒体内膜ADP/ATP载体蛋白抗原(ANT)肽段的氨基酸序列ANT-1 Pro-Ile-Glu-Arg-Val-Lys-Leu-Leu-Leu-GlnANT-2 Tyr-Asp-Glu-Ile-Lys-Lys-Phe-Val合成的β1肾上腺素能受体肽段的氨基酸序列His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-The-Asn-Arg-Cys合成的M2-胆碱能受体肽段的氨基酸序列Val-Arg-The-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-Asn-Ala-Ala-Val-The-Phe-Gly-The-Ala-Ile-Cys合成的心肌肌球蛋白重链(MHC)肽段的氨基酸序列MHC-1Glu-Ile-Glu-Arg-Lys-Leu-Ala-Glu-Lys-AspMHC-2Val-Asp-Lys-Leu-Gln-Leu-Lys-ValMHC-3Ala-Lys-Ser-Arg-Asp-Ile-Gly-Ala-Lys-Gly-Leu-Asn-Glu2.用SHIMADZU公司PSSM-8型多肽合成仪合成心肌抗原肽段，包括以下步骤(1)去保护Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂(piperidine)去除氨基的保护基团。(2)激活和交联下一个氨基酸的羧基被一种激活剂所激活。激活的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。(3)循环这两步反应反复循环直到合成完成。(4)裂解切割和脱保护多肽从柱上切割下来，其保护基团被一种脱保护剂(TFA)洗脱和脱保护。3.多肽抗原合成后分离与纯化用甲醇(优级纯)清洗5次，每次1分钟，再用t-J甲基醚(优级纯)清洗2次，此俩种清洗的目的是洗去游离的未结合的氨基酸。用脱树脂溶液(sigma公司的三氟乙酸)将合成好的多肽从树脂上切割下来，再用乙醚(分析纯)沉淀，离心分离，使脱树脂溶液(三氟乙酸)与合成好的多肽分离；倒掉上层的脱树脂溶液，最后用氮气(N2)将沉淀的合成好的多肽吹干，置-40℃冰箱保存备用。二.抗原的包被将ANT、β1、M2、MHC抗原多肽片段分别溶解于四个装有PH为9.2碳酸缓冲液的容器中，以每孔中100μl的碳酸缓冲液含1μg的相应多肽抗原量进行包被，置4℃冰箱18小时后，用洗涤液洗3次，每次3分钟，拍干后将含1％牛血清白蛋白的磷酸缓冲液作为封闭液，每孔150μl封闭，置37℃孵浴2h，以消除非特异性反应，拍干干燥后保存于4℃或-20℃冰箱备用。三.试剂的配制(1)样品的稀释液(容积比)9份磷酸缓冲液(PH7.4)+1份小牛血清；(2)辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体；(3)显色剂A200mg溶于无水乙醇100ml加水至1000ml(4)显色剂B将磷酸氢二钠14.6g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化氢尿素4.6ml溶于1000ml蒸馏水中即得显色剂B；(5)终止液为2mol/L H2S04；(6)洗液含0.1％Tween-20的0.01mol/L磷酸缓冲液(PH7.4)。(7)阴性对照血清健康人血清50μl。使用本专利技术试剂盒检测的步骤1.取出分别包被有ANT、β1、M2、MHC多肽抗原的包被板；用样品稀释液稀释待测血清，稀释度为1∶100，每孔加100μl，置37℃温浴60分钟；2用洗涤液洗3次，每次3分钟，拍干，每孔加1∶16000辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体100μl，置37℃温浴30分钟后，同上洗3次；3.加显色剂每孔分别加入显色剂A 50μl后，再在每孔中加入显色剂B 50μl，混匀，37℃温箱10分钟；4.显色完毕后，立即加50μl终止液于各反应孔；5.在酶标仪上450nm波长测定光密度值，实验中设置空白对照阴性；6.结果判断以空白对照为零，以P/N值≥2.1为阳性，P/N＝样本OD值/阴性对照OD值。使用本专利技术诊断试剂盒的注意事项有1.试剂的使用整个检测工作中应严格防止交叉感染，严格按操作程序工作；2.试剂盒保存于2-8℃，试剂开封后如未用完，应密封干燥保存；3.洗涤时应注意洗本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗心肌抗体四联诊断试剂盒，包括： Ａ．分别包被有与心肌细胞线粒体内膜ＡＤＰ／ＡＴＰ载体蛋白抗原、β↓［１］肾上腺素能受体抗原、Ｍ↓［２］－胆碱能受体抗原和心肌肌球蛋白重链抗原四种心肌抗原有相同抗原原性的人工合成的抗原多肽的包被反应板，该人工合成的抗原多肽分别具有序列表中序列１至序列７的氨基酸序列。 Ｂ．辣根过氧化物酶标记的羊抗人ＩｇＧ酶标二抗。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：廖玉华，王敏，汪朝晖，苑海涛，董继华，王朝晖，袁瑾，程翔，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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