蛋白质结晶条件的筛选方法技术

一种蛋白质结晶条件的筛选方法，其特征在于包括下述步骤：（ａ）用缓冲液溶解蛋白质，使蛋白质的终浓度达到５～５０ｍｇ／ｍｌ，用０．２２μｍ的滤膜过滤除去杂质；（ｂ）用不同的结晶缓冲液来筛选蛋白质的结晶条件；（ｃ）蛋白质晶体的形核和生长，在密 闭的可设定变温程序的控温箱中进行，预先设定该密闭环境的温度，控温箱从１～４℃开始线性升温，８～３３６小时后升温至３０～６０℃，然后从３０～６０℃线性降温，８～３３６小时后降至１～４℃，完成一个循环周期；或者设定控温箱从３０～６０℃线性降温，８～３３６小时后降至１～４℃，再从１～４℃开始线性升温，８～３３６小时后升温至３０～６０℃，完成一个循环周期；（ｄ）上述结晶体系在密闭温控箱中完成一个温度循环周期后取出，在显微镜下统计出蛋白质晶体的条件数目。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，特别是通过温度扫描对蛋白质结晶条件进 行筛选的方法。
技术介绍
结构生物学是分子生物学的前沿和主流，对蛋白质结构与功能的研究已经成为揭示基因 组功能的重要途径。获取高质量及合适尺寸的蛋白质晶体是完成结构解析的瓶颈，而结晶条 件的筛选是获得高质量蛋白质晶体的第一步，也是最关键的一步。影响蛋白质结晶条件筛选的因素是多方面的，其中温度可通过改变蛋白质的溶解性，进 而影响蛋白质在溶液中的过饱和度，而成为影响蛋白质结晶的一个重要因素。但一直以来， 人们很少在实践中运用此特点开发蛋白质结晶条件筛选技术。通常的蛋白质结晶条件筛选是在某个特定温度下进行的。文献"Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. 1991， Vol. 24: 409-41 l"公开了 一种蛋白质结晶条 件的筛选方法，选择Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒构建结晶溶液体 系。蛋白质晶体在恒温4'C和室温下生长，统计蛋白质在50种结晶缓冲液中出现晶体的成功 率。实验结果得出溶菌酶结晶成功率为10%,胰岛素结晶成功率为4%，过氧化氢酶结晶成 功率为10%，核糖核酸酶A结晶成功率为8。/。，胃蛋白酶结晶成功率为6%。由于对不同蛋白 质而言，最适合结晶的温度可能有所不同，因此在某个特定的温度下进行筛选时，适宜在其 它温度条件下结晶的缓冲液就不能产生晶体。如此将使这部分实际可以出现晶体的溶液条件 被标记为不能结晶的溶液，从而降低筛选的成功率。为了提高蛋白质结晶条件筛选的成功率， 应尽可能在所有可能结晶的温度条件下进行筛选。但这样的筛选策略在实践中由于工作量及 样品消耗量极大，实现困难。
技术实现思路
为了克服现有蛋白质结晶条件筛选技术中，因筛选温度覆盖不全而导致不能发现全部结 晶条件的不足，本专利技术提供了一种新的。该方法通过温度扫描， 可覆盖筛选过程中可能结晶的每一个温度点，以此提高蛋白质结晶筛选的成功率。本专利技术解决其技术问题的技术方案是， 一种，其特征在于包括以下步骤(a)用缓冲液溶解蛋白质，使蛋白质的终浓度达到5 50mg/ml，用0.22 pm的滤膜过滤 除去杂质；(b) 用不同的结晶缓冲液来筛选蛋白质的结晶条件；(c) 蛋白质晶体的形核和生长，在密闭的可设定变温程序的控温箱中进行，预先设定该 密闭环境的温度，控温箱从1 4-C开始线性升温，8 336小时后升温至30 60°C，然后从 30 60'C线性降温，8 336小时后降至1 4°C，完成一个循环周期；或者设定控温箱从30 60'C线性降温，8 336小时后降至1 4°C，再从1 4'C开始线性升温，8 336小时后升温 至30 60'C，完成一个循环周期；(d) 上述结晶体系在密闭温控箱中完成一个温度循环周期后取出，在显微镜下统计出蛋 白质晶体的条件数目。本专利技术的有益效果是由于采用了温度扫描方式，可以通过一次实验覆盖适宜于蛋白质 结晶的所有可能温度，而不用在所有可能结晶的温度点下一一建立实验组进行筛选，从而提 高实验效率，并节约结晶缓冲液和蛋白质样品。通过本专利技术，可使蛋白质结晶条件筛选成功 率由过去的4 10%提高至14 50%。下面结合实施例对本专利技术作详细说明。具体实施例方式实施例l:溶菌酶结晶条件的筛选。第一步将经过六次重结晶的日本Seikagaku公司的货号为100940的溶菌酶，溶于pH 为4.60， 0.1 mol/L的醋酸钠缓冲液中，使其终浓度为20 mg/ml，用0.22 pm的滤膜滤去杂质。第二步本实施例用Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒的50种结晶 缓冲液对溶菌酶结晶条件进行筛选。第三步将整个结晶体系放置于可进行程序温度控制的温控箱中，其温控热源为可编程 的高低温循环水浴，型号为PolyScience 9712AA2Y。具体温控程序为从rC线性升温168小时至60°c，然后再以同样变温速率从6(Tc降温至rc，即一个温控周期为 ix^^6ot:，^i"c。或者从60t:线性降温i68小时至it:，然后再以同样变温速率从i°c线性升温至60°C。第四步样品在温控箱中放置一个温度循环周期后，在显微镜下观察统计出溶菌酶晶体 的条件数目，并计算结晶筛选的成功率。经过统计得到如下结果有21种结晶条件出现了溶菌酶晶体，结晶成功率为42%。与现 有技术在4'C和室温筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了 4.2倍。实施例2:胰岛素结晶条件的筛选。第一步将美国Sigma公司货号为15500的胰岛素，溶于1 mol/L的氨水中，使其终浓度 为30 mg/ml，用0.22 pm的滤膜滤去杂质。第二步本实施例用Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒的50种结晶缓冲液对胰岛素的结晶条件进行筛选。第三步将整个结晶体系放置于可进行程序温度控制的温控箱中，其温控热源为可编程 的高低温循环水浴，型号为PolyScience 9712AA2Y。具体温控程序为从2'C线性升温24小 时至35°C，然后再以同样变温速率从35'C降温至2°C,即一个温控周期为 2'c"^^35'c2"^"l2"C。或者从35-C线性降温24小时至2'C，再以同样变温速率从2'C线性 升温至35'C。第四步样品在温控箱中放置一个温度循环周期后，在显微镜下观察统计出胰岛素晶体 的条件数目，并计算结晶筛选的成功率。经过统计得到如下结果有25种结晶条件出现了胰岛素酶晶体，结晶成功率为50%。与 现有技术在4'C和室温筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了 12.5倍。实施例3:过氧化氢酶结晶条件的筛选。第一步将美国Sigma公司货号为C0615的过氧化氢酶，溶于pH为7.00， 0.025 mol/L HEPES-Na缓冲液中，使其终浓度为40 mg/ml，用0.22 pm的滤膜滤去杂质。第二步本实施例用Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒的50种结晶 缓冲液对过氧化氢酶的结晶条件进行筛选。第三步将整个结晶体系放置于可进行程序温度控制的温控箱中，其温控热源为可编程 的高低温循环水浴，型号为PolyScience 9712AA2Y。具体温控程序为从4"C线性升温8小 时至30'C，然后再以同样变温速率从3(TC降温至4'C。或者从3(TC线性降温8小时至4"C， 然后再以同样变温速率从4'C线性升温至30°C 。第四步样品在温控箱中放置一个温度循环周期后，在显微镜下观察统计出过氧化氢酶 晶体的条件数目，并计算结晶筛选的成功率。经过统计得到如下结果有13种结晶条件出现了过氧化氢酶晶体，结晶成功率为26%。 与现有技术在4。C和室温筛选结晶条件的结果相比，成功率提高了 2.6倍。实施例4:核糖核酸酶A结晶条件的筛选。第一步将美国Sigma公司货号为R5500的核糖核酸酶A，溶于pH为7.00， 0.025 mol/L HEPES-Na缓冲液中，使其终浓度为5 mg/ml，用0.22 ^un的滤膜滤去杂质。第二步本实施例用Hampton公司货号为HR2-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质结晶条件的筛选方法，其特征在于包括下述步骤：（ａ）用缓冲液溶解蛋白质，使蛋白质的终浓度达到５～５０ｍｇ／ｍｌ，用０．２２μｍ的滤膜过滤除去杂质；（ｂ）用不同的结晶缓冲液来筛选蛋白质的结晶条件；（ｃ）蛋白质晶体的形核和生长，在密闭的可设定变温程序的控温箱中进行，预先设定该密闭环境的温度，控温箱从１～４℃开始线性升温，８～３３６小时后升温至３０～６０℃，然后从３０～６０℃线性降温，８～３３６小时后降至１～４℃，完成一个循环周期；或者设定控温箱从３０～６０℃线性降温，８～３３６小时后降至１～４℃，再从１～４℃开始线性升温，８～３３６小时后升温至３０～６０℃，完成一个循环周期；（ｄ）上述结晶体系在密闭温控箱中完成一个温度循环周期后取出，在显微镜下统计出蛋白质晶体的条件数目。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：尹大川，张辰艳，鹿芹芹，郭云珠，郭卫红，王玺凯，李海生，卢慧甍，叶雅静，
申请(专利权)人：西北工业大学，
类型：发明
国别省市：87