一种海藻糖酶基因Bx-tre1及其应用制造技术

一种海藻糖酶基因Bx‑tre1及其应用，它涉及一种海藻糖酶基因Bx‑tre1及其应用。本发明专利技术的目的是为了解决松材线虫抗逆态幼虫可进入变渗隐生状态在高渗透压环境下存活，从而导致松材线虫蔓延的问题。本发明专利技术应用在松树病害防治上。海藻糖酶基因的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。本发明专利技术通过基因沉默降低海藻糖酶基因在松材线虫雄虫中的表达量，可有效降低海藻糖酶酶活，阻断海藻糖代谢路径，从而显著降低松材线虫雄虫在高渗透压胁迫下的存活率，进而抑制有性繁殖，本发明专利技术应用于松材线虫防治领域。

A Trehalase Gene Bx-tre1 and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种海藻糖酶基因Bx-tre1及其应用
本专利技术涉及一种海藻糖酶基因Bx-tre1及其应用。
技术介绍
松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起松树萎蔫病(pinewiltdisease)，从北美传入东亚后已危害日本、中国和韩国松林近半个世纪，造成巨大的经济损失。该线虫的生活史复杂，适应环境的能力较强，目前已逐步向北方寒冷地区扩散。寒冷地区松树适应低温环境，为防止由于树体含水量过高而冻裂，树木新陈代谢在秋季开始减慢，树体含水量下降，渗透压急剧上升，不利于松材线虫存活。但对大连和抚顺地区越冬的松材线虫采样调查表明，松材线虫可通过进入变渗隐生状态在高渗透压环境下存活，进而成功越冬。松材线虫进入变渗隐生状态时，新陈代谢趋于停滞，当外界环境适宜时，新陈代谢又恢复正常。因此，阻断松材线虫通过变渗隐生度过高渗透压环境，可成为防治该线虫的新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决松材线虫抗逆态幼虫可进入变渗隐生状态在高渗透压环境下存活，从而导致松材线虫蔓延的问题，提供一种海藻糖酶基因Bx-tre1及其应用。本专利技术一种海藻糖酶基因Bx-tre1的核苷酸序列如序列表SeqIDNo：1所示，长度为1413bp。本专利技术海藻糖酶基因Bx-tre1应用在松树病害防治上。海藻糖(trehalose)是一种非还原性二糖(α-D-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖苷)，具有极强的吸水性可作为渗透保护剂，在保护线虫细胞膜结构的完整性和防止蛋白质变性方面起重要作用。海藻糖酶(trehalase)是唯一专一性地将海藻糖水解为葡萄糖的水解酶。海藻糖酶可与激素协同作用，调控生物体内海藻糖和葡萄糖等糖类物质的浓度，以保护体内细胞，使生物适应并度过相应的逆境环境。因此，海藻糖酶是海藻糖代谢中的关键酶。对松材线虫各个虫龄海藻糖酶基因表达量测定中发现，雄虫的海藻糖酶基因(Bx-tre1)的表达量显著高于其它虫龄。若通过对Bx-tre1进行基因沉默，阻断雄虫通过变渗隐生度过高渗透压环境，则可有效抑制松材线虫的有性繁殖，为防治该线虫提供新思路。本专利技术的有益效果是：本专利技术的海藻糖酶基因在松材线虫雄虫中表达量显著高于其它虫龄，表明该基因对于松材线虫雄虫至关重要。通过基因沉默降低该基因在松材线虫雄虫中的表达量，可有效降低海藻糖酶酶活，阻断海藻糖代谢路径，从而降低松材线虫雄虫在高渗透压胁迫下55％-60％的存活率，进而抑制有性繁殖，在防治松材线虫中具有重要的应用价值。附图说明图1为实施例1中Q-PCR技术检验Bx-tre1基因沉默效果图；图2为实施例1中分别对松材线虫进行Bx-tre1基因沉默处理与对照处理后，海藻糖酶酶活和海藻糖含量对比图；图3为实施例1中分别对松材线虫进行Bx-tre1基因沉默处理与对照处理后，进行高渗透压胁迫时松材线虫存活率对比图。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式一种海藻糖酶基因Bx-tre1的核苷酸序列如序列表SeqIDNo：1所示，长度为1413bp。本实施方式的海藻糖酶基因在松材线虫雄虫中表达量显著高于其它虫龄，表明该基因在松材线虫雄虫中起到重要作用。通过基因沉默降低该基因在松材线虫雄虫中的表达量，可有效降低海藻糖酶酶活，阻断海藻糖代谢路径，从而降低松材线虫雄虫在高渗透压胁迫下55％-60％的存活率，进而抑制有性繁殖，在防治松材线虫中具有重要的应用价值。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：构建海藻糖酶基因Bx-tre1的上游引物的核苷酸序列如序列表SeqIDNo：2所示；下游引物的核苷酸序列如序列表SeqIDNo：3所示。其他与具体实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式海藻糖酶基因Bx-tre1应用在松树病害防治上。具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：海藻糖酶基因Bx-tre1在松材线虫防治上的应用。其他与具体实施方式三相同。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三或四不同的是：在松材线虫防治上是指通过海藻糖酶基因Bx-tre1影响松材线虫的有性繁殖。其他与具体实施方式三或四相同。具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式三至五之一不同的是：影响松材线虫有性繁殖的方法为：通过基因沉默降低海藻糖酶基因Bx-tre1在松材线虫雄虫中的表达量，从而降低海藻糖酶酶活，阻断海藻糖代谢路径，进而阻断松材线虫雄虫通过变渗隐生度过高渗透压环境，降低松材线虫雄虫在高渗透下胁迫下的存活率，最终降低松材线虫的有性繁殖。其他与具体实施方式三至五之一相同。具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式三至六之一不同的是：基因沉默的方法为：采用浓度为3mg/mL的dsRNA浸泡法处理松材线虫雄虫6-48h。其他与具体实施方式三至六之一相同。具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式三至七之一不同的是：构建dsRNA的引物组为：合成正义链RNA上游引物Bx-tre1-TTF的核苷酸序列如序列表SeqIDNo.4所示；合成正义链RNA下游引物Bx-tre1-iR的核苷酸序列如序列表SeqIDNo.5所示；合成反义链RNA上游引物Bx-tre1-iF的核苷酸序列如序列表SeqIDNo.6所示；合成反义链RNA下游引物Bx-tre1-T7R的核苷酸序列如序列表SeqIDNo.7所示。其他与具体实施方式三至七之一相同。具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式三至八之一不同的是：海藻糖酶基因Bx-tre1Q-PCR检测的引物组为：上游引物Bx-tre1-qF：如序列表SeqIDNo.8所示，下游引物Bx-tre1-qR：如序列表SeqIDNo.9所示。其他与具体实施方式三至八之一相同。通过以下实验验证本专利技术的效果：实施例1：海藻糖酶基因Bx-tre1的获得及其功能验证：(一)RNA抽提及cDNA合成：DEPC处理水清洗松材线虫雄虫，离心去水后，液氮下研磨。取研磨粉末，应用TRIzol法(Invitrogen，cat.No.15596-026)提取总RNA。DEPC处理水溶解RNA后，应用AMV反转录系统(Promega，cat.No.A3500)，以Oligo(dT)18为引物，合成第一链cDNA。根据试验手册，应用随机引物法合成第二链cDNA。(二)松材线虫海藻糖酶基因Bx-tre1完整阅读框克隆根据转录组测序结果合成松材线虫海藻糖酶基因Bx-tre1引物组：Bx-tre1-F:5`-GATCAAGAATGCGCCGGAAC-3`，Bx-tre1-R:5`-TGGAACACCTCCATCTTCGC-3`。以cDNA为模板进行完整阅读框序列的PCR扩增(TaKaRar-Taq酶50μL反应体系：94℃30s，58℃1min，72℃1min，进行35个循环)，扩增得到全长为1413bp的序列，其核苷酸序列如序列表中的SEQIDNo：1所示，送生物公司测序，验证后命名为Bx-tre1。(三)Bx-tre1基因沉默以松材线虫雄虫cDNA为模板，应用引物组：Bx-tre1-T7F：5`-TAATACGACTCACTATAGGGCACAACCTCCACTTCTCGCT-3`，Bx-tre1-iR：5`-TCGCTAAAAGCCCCCTTCAA-3`进行PCR扩增生产正义链模板。应用引物组：Bx-tre1-iF：5`-C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海藻糖酶基因Bx‑tre1，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示，长度为1413bp。

【技术特征摘要】
1.一种海藻糖酶基因Bx-tre1，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SeqIDNo：1所示，长度为1413bp。2.根据权利要求1所述的一种海藻糖酶基因Bx-tre1，其特征在于构建海藻糖酶基因Bx-tre1的上游引物的核苷酸序列如序列表SeqIDNo：2所示；下游引物的核苷酸序列如序列表SeqIDNo：3所示。3.权利要求1所述的海藻糖酶基因Bx-tre1在松树病害防治上的应用。4.根据权利要求3所述的海藻糖酶基因Bx-tre1在松树病害防治上的应用，其特征在于海藻糖酶基因Bx-tre1在松材线虫防治上的应用。5.根据权利要求4所述的海藻糖酶基因Bx-tre1在松树病害防治上的应用，其特征在于在松材线虫防治上是指通过海藻糖酶基因Bx-tre1影响松材线虫的有性繁殖。6.根据权利要求5所述的海藻糖酶基因Bx-tre1在松树病害防治上的应用，其特征在于影响松材线虫有性繁殖的方式为：通过基因沉默降低海藻糖酶基因Bx-...

【专利技术属性】
技术研发人员：王峰，陈俏丽，王佳楠，李丹蕾，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23