草鱼adiponectin A基因、编码蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种草鱼adiponectin A基因、编码蛋白及其应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术的技术方案要点为：草鱼adiponectin A基因，该草鱼adiponectin A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，还公开了含有上述草鱼adiponectin A基因的重组表达载体、重组菌株及其在制备草鱼促生长剂或添加剂中的应用。本发明专利技术首次扩增编码草鱼adiponectin A蛋白的基因，并将该基因构建表达载体和重组大肠杆菌菌株，利用重组大肠杆菌菌种在体外获得大量表达的草鱼adiponectin A蛋白，该蛋白可以用于制备适合草鱼使用的促生长剂或添加剂。

Adponectin A Gene, Coded Protein and Its Application in Grass Carp

【技术实现步骤摘要】
草鱼adiponectinA基因、编码蛋白及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种草鱼adiponectinA基因、编码蛋白及其应用。
技术介绍
脂肪组织不仅能够储存能量，还是一个功能活跃的内分泌器官。由脂肪细胞合成和分泌，并释放到循环系统中的内分泌因子，被统称为脂肪细胞因子，它们对糖类和脂质代谢的调控发挥着重要作用。脂联素(adiponectin)是哺乳类血液中蛋白水平最高的脂肪细胞因子，它与其受体(AdipoR1和AdipoR2)结合后，能够通过激活AMPK和PPARα等信号通路，改善胰岛素抵抗，提高葡萄糖的摄入量，促进脂肪酸的β氧化作用。因此，脂联素具有促进葡萄糖摄取、降血糖、抗脂肪肝病等生理功能。草鱼属鲤形目，鲤科，雅罗鱼亚科，草鱼属。草鱼以其肉质细嫩、个体大、肌间刺少而备受消费者喜爱。在我国大宗淡水鱼中，草鱼养殖产量常年位居第一。目前草鱼饲料还需要添加大量的动植物蛋白，但蛋白质成本高昂，而糖类和脂肪则价格较为低廉。糖类和脂肪可以减少用于供能所消耗的蛋白质，具有节约蛋白质的作用。饲料中适当提高糖类和脂质的含量，可以替代部分作为能源消耗的蛋白质，从而提高蛋白质的利用率。饲料中糖的含量过高也会引起生长缓慢，鱼对糖的利用能力有限；脂类含量太高会导致脂肪肝，使肝功能减弱，解毒力下降。但目前在草鱼人工养殖中还没有一种能有效促进糖类和脂质利用的饲料添加剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种草鱼adiponectinA基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌株及其在制备草鱼促生长剂或添加剂中的应用。本专利技术为实现上述目的采用如下技术方案，草鱼adiponectinA基因，该草鱼adiponectinA基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术扩增了编码草鱼adiponectinA蛋白的基因，克隆的方法是常规的基因克隆方法，通过设计引物，利用草鱼肾脏cDNA为模板，经过PCR后得到目的基因片段，对PCR产物进行回收后，将得到的目的基因片段连接到pMD19-T载体为pMD19-T-adiponectinA。本专利技术提供了上述草鱼adiponectinA基因编码的草鱼adiponectinA蛋白，该草鱼adiponectinA蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术构建了含有编码草鱼adiponectinA蛋白的大肠杆菌表达载体，该表达载体的构建方法是按常规同源重组的方法。利用原核表达质粒pET22b为模板，通过PCR方法进行线性化；利用自己构建的pMD19-T-adiponectinA载体为模板，通过PCR方法在编码草鱼adiponectinA蛋白基因的两侧引入与载体克隆位点两端完全一致的15bp同源序列，得到带有酶切接头的编码草鱼adiponectinA蛋白的基因。分别经分离纯化后，将两者进行同源重组连接，即构建成含有编码草鱼adiponectinA蛋白基因的表达载体pET22b-adiponectinA。本专利技术还用上述含有编码草鱼adiponectinA蛋白的相应表达载体pET22b-adiponectinA构建了能够高效表达草鱼adiponectinA蛋白的大肠杆菌重组菌株。该重组菌株由含有编码草鱼adiponectinA蛋白基因的表达载体pET22b-adiponectinA转化大肠杆菌BL21而得到的菌株，命名为pET22b-adiponectinA-BL21。本专利技术还提供了利用上述大肠杆菌重组菌株生产草鱼adiponectinA蛋白的方法。将上述重组菌株接种在LB液体培养基中，37℃，20rpm培养14-16h，按照体积比1:100接种在500mLLB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD600达到0.5-0.8，然后加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，200rpm培养3h后6000g离心10min收集菌体，超声破碎后6500g离心15min收集沉淀，沉淀用含有6M尿素的Bindingbuffer溶解后，经分离纯化得到重组草鱼adiponectinA蛋白。本专利技术还提供了重组草鱼adiponectinA蛋白的复性、浓缩和脱盐的方法。将纯化得到的重组草鱼adiponectinA蛋白加入到透析袋中，依次放入含有4M、2M、尿素的PBS中，4℃分别透析12h，然后放入含尿素的PBS继续4℃透析24h，每12h更换1次PBS。将透析后的重组草鱼adiponectinA蛋白加入到超滤管，4℃5000g离心2-3h，使超滤管中蛋白溶液至1mL左右，弃滤出液，向超滤管中加入10mL的PBS，反复重复4次得到去除咪唑的重组草鱼adiponectinA蛋白。草鱼具有重大的经济价值，采用常规的基因工程技术，可利用本专利技术的草鱼adiponectinA基因重组株pET22b-adiponectinA-BL21，生产重组草鱼adiponectinA蛋白，并可进一步用作制备适合草鱼使用的促生长剂或添加剂。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次扩增编码草鱼adiponectinA蛋白的基因，并将该基因构建表达载体和重组大肠杆菌菌株，利用重组大肠杆菌菌种在体外获得大量表达的草鱼adiponectinA蛋白，该蛋白可以用于制备适合草鱼使用的促生长剂或添加剂。附图说明图1是以草鱼肾脏的反转录cDNA为模板进行PCR扩增adiponectinA的凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1：PCR扩增产物；图2是pET22b载体线性化PCR扩增及带有载体同源序列的编码草鱼adiponectinA蛋白基因片段PCR扩增凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1-4：pET22b载体线性化PCR扩增产物；5：带有载体同源序列的编码草鱼adiponectinA蛋白的基因片段PCR扩增产物；图3是重组质粒pET22b-adiponectinA的凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1：pET22b-adiponectinA；图4中A是重组株pET22b-adiponectinA-BL21表达产物adiponectinA的SDS-PAGE电泳分析图，其中：M：蛋白Marker；1：空载体对照；2：未诱导；3、4、5、6是分别用IPTG诱导1、2、3、4小时。B和C是重组株pET22b-adiponectinA-BL21表达产物adiponectinA纯化产物的SDS-PAGE电泳分析图和Westernblot鉴定，其中，M：蛋白Marker；1-6：纯化后adiponectinA蛋白；图5是重组草鱼adiponectinA蛋白对草鱼血糖、血清甘油三酯和血清游离脂肪酸含量的影响；A是血糖(glucose)；B是血清甘油三酯(TG)；C是血清游离脂肪酸(FFA)。其中，柱子上的不同英文字母表示差异性显著。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本专利技术上述内容实现的技术均属于本专利技术的范围。实施例1编码草鱼adiponectinA蛋白基因片段的克隆设计两对引物，第1对引物的正向引物序列为5'TCTCAAAAGGCAAAAGGACA3'，反向引物序列为5'AACAAGCACCCCACCAGTA3'；第2对引物的正向引物序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.草鱼adiponectin A基因，其特征在于：该草鱼adiponectin A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.草鱼adiponectinA基因，其特征在于：该草鱼adiponectinA基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。2.权利要求1所述的草鱼adiponectinA基因编码的草鱼adiponectinA蛋白，其特征在于：该草鱼adiponectinA蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。3.一种含有权利要求1所述的草鱼adiponectinA基因的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体利用原核表达质粒pET22b为模板，通过PCR方法进行线性化；再利用自己构建的pMD19-T-adiponectinA载体为模板，通过PCR方法在编码草鱼adiponectinA蛋白基因的两侧引入与载体克隆位点两端完全一致的15bp同源序列，得到带有酶切接头的编码草鱼adiponectinA蛋白的基因，分别经分离纯化后，将两者进行同源重组连接，即构建成含有编码草鱼adiponectinA蛋白基因的表达载体pET22b-adiponectinA。5.权利要求3或4所述的重组表达载体转化的大肠杆菌重组菌株，其特征在于：该重组菌株是由含有编码草鱼adiponectinA蛋白基因的表达载体pET22b-adiponectinA转化大肠杆菌BL21而得到的重组菌株pET22b-adiponectinA-BL21。6.权利要求5所述的大肠杆菌重组菌株在制备重组草鱼adiponectinA蛋白中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦超彬，赵文丽，杨国坤，聂国兴，杨丽萍，孟晓林，卢荣华，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南,41