一种冬虫夏草多糖提取物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于中药材提取领域，提供了一种冬虫夏草多糖提取物及其制备方法和应用，具体地，提供了一种冬虫夏草多糖提取物的制备方法，及经这样的制备方法制备的具有较高抗肿瘤活性的冬虫夏草多糖提取物，还提供了这样的冬虫夏草多糖提取物在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。所述制备方法包括用乙醇醇沉粗多糖，用Sevag试剂进行脱蛋白，以及用大孔树脂脱色素的步骤，从而获得经脱蛋白和脱色素的冬虫夏草多糖提取物。

A polysaccharide extract from Cordyceps sinensis and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种冬虫夏草多糖提取物及其制备方法和应用
本专利技术属于中药材提取领域，涉及中药材多糖提取物的制备，特别是涉及冬虫夏草多糖提取物的制备及其应用。
技术介绍
冬虫夏草为我国传统的名贵中药材，隶属于子囊菌门(Ascomycota)粪壳菌纲(Sordariomycetes)，肉座菌目(Hypocreales)，线虫草科(Ophiocordycipitaceae)，在我国具有悠久的药用历史，具有补肺益肾、止血化痰的功效。现代化学和药理研究表明，冬虫夏草含有核苷、糖类、甾醇、蛋白质等多类化学成分，具有调节免疫力、缓解肺部疾病、抗肿瘤等药理作用。前期也有文献报告冬虫夏草具有抗肿瘤作用，如文献《虫草多糖的药理作用》[中草药，1985，16(7):18-23]记载虫草多糖浓度为100mg/10g时对小鼠肉瘤S180抑制率为28％～33％；文献《EffectofcordycepssinensisontheproliferationanddifferentiationofhumanleukemicU937cells》[lifesciences,60(25):2349-2359]报道了冬虫夏草多糖浓度为10μg/mL时对人白血病U937细胞抑制率为78％～83％；也有部分研究是针对冬虫夏草粗提取液的抗肿瘤活性，如专利《一种抗肿瘤活性的鲜冬虫夏草提取物及其制备方法和应用》(申请号：CN201611221881.5)公开了鲜冬虫夏草水提取物在浓度为0.25～3mg/mL时对乳腺癌细胞MDA-MB-453的抑制率为39.0％～86.7％。多糖广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中，是一类天然高分子化合物，真菌多糖是一类从真菌的子实体、菌丝体或发酵液中分离出来的，有些真菌多糖具有抗病毒、抗凝血、抗肿瘤、免疫调节、降血脂等多种生物活性。然而，由于真菌多糖提取过程中受到蛋白、色素脱除的影响，而且，还存在提取纯度差、稳定性不高，如多糖本身的高极性、挥发难、热不稳定性、分子量高等特点，使得真菌多糖的提取存在诸多难题。目前，对于具有较高抗肿瘤活性的冬虫夏草多糖提取物存在着很大的需求。
技术实现思路
本专利技术提供了一种冬虫夏草多糖提取物的制备方法，提供了经这样的制备方法制备的具有较高抗肿瘤活性的冬虫夏草多糖提取物，还提供了这样的冬虫夏草多糖提取物在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。本专利技术的冬虫夏草多糖提取物是经脱蛋白并且脱色素的多糖提取物，对癌细胞具有较好的抑制活性，尤其是对血癌K-562细胞有良好的抑制活性。第一方面，本专利技术提供了一种冬虫夏草多糖提取物的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)将冬虫夏草用水加热提取得到提取物，并用水洗脱获得水提物；(2)向步骤(1)中获得的水提物中加入乙醇进行醇沉得到醇沉粗多糖；(3)将步骤(2)获得的醇沉粗多糖溶于水中得到粗多糖溶液，之后按照粗多糖溶液与sevag试剂的体积比为3:1～5:1加入sevag试剂进行脱蛋白，得到脱蛋白后的粗多糖；以及(4)将步骤(3)获得的脱蛋白后的粗多糖用大孔树脂进行脱色素。优选地，所述方法包括如下步骤：(1)将冬虫夏草用水在80℃-100℃下加热提取得到提取物，并用水洗脱获得水提物；(2)向步骤(1)中获得的水提物中加入乙醇进行醇沉得到醇沉粗多糖；(3)将步骤(2)获得的醇沉粗多糖按照料液比1:18～1:22(g/mL)溶于水中得到粗多糖溶液，之后按照粗多糖溶液与sevag试剂的体积比为3:1～5:1加入sevag试剂进行脱蛋白，得到脱蛋白后的粗多糖；以及(4)将步骤(3)获得的脱蛋白后的粗多糖用大孔树脂进行脱色素。优选地，所述步骤(1)中，加热提取为回流提取，加热提取的料液比为1:8-1:12(kg/L)，提取2-4小时；优选地，所述加热提取后的残渣继续按照料液比为1:8-1:12(kg/L)进行回流提取2-3次，每次提取2-4h，合并提取液。优选地，在步骤(1)得到提取物之后将提取物用大孔树脂吸附并用水洗脱获得水提物。优选地，所述步骤(2)中水提物为料液比为1:3-1:6(g/mL)的水提物水溶液；所述步骤(2)中乙醇为无水乙醇，所述无水乙醇与水提物水溶液的体积比为3:1-5:1。优选地，所述步骤(2)中水提物为料液比为1:5(g/mL)的水提物水溶液；所述步骤(2)中乙醇为无水乙醇，所述无水乙醇与水提物水溶液的体积比为4:1。优选地，所述步骤(2)中醇沉在室温下进行，醇沉时间大于8小时。优选地，所述步骤(3)中粗多糖溶液与sevag试剂的体积比为4:1。优选地，在步骤(4)之前重复进行步骤(3)直至离心后的水相层与有机相间无蛋白层，得到脱蛋白后的水相层溶液作为脱蛋白后的粗多糖，具体而言，重复如下步骤：向所述粗多糖溶液中加入sevag试剂，充分震荡后离心，取水相层并重复进行脱蛋白操作直至离心后的水相层与有机相间无蛋白层，得到脱蛋白后的水相层溶液即为脱蛋白后的粗多糖；优选地，所述脱蛋白后的水相层溶液中进一步加入4-5倍体积的无水乙醇，醇沉后离心得脱蛋白后的粗多糖。优选地，在所述步骤(3)中，向脱蛋白后的水相层溶液中边搅拌边缓慢加入4-5倍体积的无水乙醇，在4℃，醇沉过夜，然后5000rpm离心10分钟，得脱蛋白粗多糖(DPCSP)。优选地，在所述步骤(4)中，大孔树脂为AB-8大孔树脂，D-941大孔树脂，D-113大孔树脂，或D-101大孔树脂；更优选地，在所述步骤(5)中，大孔树脂为AB-8大孔树脂。优选地，所述步骤(4)为：将步骤(3)中获得的脱蛋白后的粗多糖加到AB-8大孔树脂柱上，用水洗脱得洗脱液，浓缩，并用2kDa透析袋纯水透析，得到透析后的透析袋内溶液；优选地，所述透析袋内溶液进一步冷冻干燥得到脱色素粗多糖(DCCSP)。优选地，本专利技术提供了一种冬虫夏草多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：(1)将粉碎的冬虫夏草用水回流提取2-4小时，提取的料液比为1:8-1:12(kg/L)；优选地，所述回流提取后的残渣继续按照料液比为1:8-1:12(kg/L)进行回流提取2-3次，每次提取2-4h，合并提取液；将提取液浓缩得到提取物，用HP-20大孔树脂吸附并用水洗脱，洗脱液浓缩、冷冻干燥后获得水提物；(2)将步骤(1)中获得的水提物按照料液比1:3～1:6(g/mL)溶于水中得到水提物水溶液；然后加入无水乙醇进行醇沉得到醇沉粗多糖，其中所述无水乙醇与水提物水溶液的体积比为3:1-5:1；(3)将步骤(2)获得的醇沉粗多糖按照料液比1:18～1:22(g/mL)加入水中得到粗多糖溶液，之后按照粗多糖溶液与sevag试剂的体积比4:1加入sevag试剂进行脱蛋白，具体操作为：向所述粗多糖溶液中加入sevag试剂，充分震荡后离心，取水相层并重复进行脱蛋白操作直至离心后的水相层与有机相间无蛋白层，得到脱蛋白后的水相层溶液即为脱蛋白后的粗多糖；优选地，所述脱蛋白后的水相层溶液中进一步加入4-5倍体积的无水乙醇，醇沉然后离心得到脱蛋白后的粗多糖；以及(4)将步骤(3)获得的脱蛋白后的粗多糖加到AB-8大孔树脂柱上，用水洗脱得洗脱液，浓缩，并用2kDa透析袋纯水透析得到透析后的透析袋内溶液；优选地，所述透析袋内溶液进一步冷冻干燥得到脱色素粗多糖(DCCSP)。优选地，本专利技术提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种冬虫夏草多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：(1)将冬虫夏草用水加热提取得到提取物，并用水洗脱获得水提物；(2)向步骤(1)中获得的水提物中加入乙醇进行醇沉得到醇沉粗多糖；(3)将步骤(2)获得的醇沉粗多糖溶于水中得到粗多糖溶液，之后按照粗多糖溶液与sevag试剂的体积比为3:1～5:1加入sevag试剂进行脱蛋白，得到脱蛋白后的粗多糖；以及(4)将步骤(3)获得的脱蛋白后的粗多糖用大孔树脂进行脱色素。

【技术特征摘要】
1.一种冬虫夏草多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：(1)将冬虫夏草用水加热提取得到提取物，并用水洗脱获得水提物；(2)向步骤(1)中获得的水提物中加入乙醇进行醇沉得到醇沉粗多糖；(3)将步骤(2)获得的醇沉粗多糖溶于水中得到粗多糖溶液，之后按照粗多糖溶液与sevag试剂的体积比为3:1～5:1加入sevag试剂进行脱蛋白，得到脱蛋白后的粗多糖；以及(4)将步骤(3)获得的脱蛋白后的粗多糖用大孔树脂进行脱色素。2.一种冬虫夏草多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：(1)将冬虫夏草用水在80℃-100℃下加热提取得到提取物，并用水洗脱获得水提物；(2)向步骤(1)中获得的水提物中加入乙醇进行醇沉得到醇沉粗多糖；(3)将步骤(2)获得的醇沉粗多糖按照料液比1:18～1:22(g/mL)溶于水中得到粗多糖溶液，之后按照粗多糖溶液与sevag试剂的体积比为3:1～5:1加入sevag试剂进行脱蛋白，得到脱蛋白后的粗多糖；以及(4)将步骤(3)获得的脱蛋白后的粗多糖用大孔树脂进行脱色素。3.根据权利要求1或2所述的方法，所述步骤(1)中，加热提取为回流提取，加热提取的料液比为1:8-1:12(kg/L)，提取2-4小时；优选地，所述加热提取后的残渣继续按照料液比为1:8-1:12(kg/L)进行回流提取2-3次，每次提取2-4小时，合并提取液；优选地，在步骤(1)得到提取物之后将提取物用大孔树脂吸附并用水洗脱获得水提物。4.根据权利要求1或2所述的方法，所述步骤(2)中水提物为料液比为1:3-1:6(g/mL)的水提物水溶液；所述步骤(2)中乙醇为无水乙醇，所述无水乙醇与水提物水溶液的体积比为3:1-5:1；优选地，所述步骤(2)中水提物为料液比为1:5(g/mL)的水提物水溶液；所述步骤(2)中乙醇为无水乙醇，所述无水乙醇与水提物水溶液的体积比为4:1。5.根据权利要求1或2所述的方法，所述步骤(2)中醇沉在...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱正明，李春红，赵彪希，甄达明，李文佳，
申请(专利权)人：东莞东阳光保健品研发有限公司，广东东阳光药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44