包含CD28和4-1BB的嵌合抗原受体及其应用制造技术

本申请涉及一种嵌合抗原受体及其应用。所述嵌合抗原受体，包括，肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、胞内的共刺激信号结构域、信号转导结构域；其中，所述共刺激信号结构域包括CD28和4‑1BB功能区，所述4‑1BB功能区包括QEED和EEEE。本申请提供的CAR，包含了两个共刺激信号序列突变体的CAR在体外的增殖能力更强，为临床上治疗白血病提供新的肿瘤细胞药物，也为临床上用嵌合抗原疗法治疗实体瘤提供新的设计思路。

Chimeric antigen receptors containing CD28 and 4-1BB and their applications

【技术实现步骤摘要】
包含CD28和4-1BB的嵌合抗原受体及其应用
本申请涉及抗肿瘤药物制备领域，具体涉及一种嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，特别是，白血病、淋巴瘤等血液肿瘤的发病率居高不下。已用于临床治疗白血病和淋巴瘤的药物有KymriahTM和Yescart。它们在临床上达到了一定的治疗效果，但是，经其治疗后的白血病和淋巴瘤仍然会复发；并且存在细胞因子风暴，神经毒性等副反应。且病人的缓解率不够高，还需要桥接骨髓移植等其他治疗手段。桥接骨髓移植也存在较大的缺陷，如符合配型要求的骨髓难以获取，移植并发症较多，移植后复发率较高等等。因此，临床上迫切需要开发新型血液肿瘤治疗手段，以便满足患者的需求。
技术实现思路
本申请提供一种嵌合抗原受体及其应用，可延长T细胞在体内的存续时间，改善肿瘤治疗效果，降低肿瘤的复发率。第一方面，本申请实施例提供了一种嵌合抗原受体，肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、胞内的共刺激信号结构域、信号转导结构域；其中，所述共刺激信号结构域包括CD28和4-1BB功能区，所述4-1BB功能区包括QEED和EEEE。在一些实施例中，所述肿瘤抗原结合结构域包括靶向CD19的单链抗体，所述靶向CD19的单链抗体的序列如SEQNO:1所示；所述胞外铰链及跨膜结构域包括CD28胞外铰链及跨膜结构域；所述信号转导结构域包括CD3ζ，所述CD3ζ的序列如SEQNO:3所示。在一些实施例中，所述共刺激信号结构域为CD28序列和4-1BB全长序列的组合；所述的嵌合抗原受体序列如SEQNO:4所示。在一些实施例中，所述共刺激信号结构域为CD28序列和4-1BB功能区序列的组合；所述的嵌合抗原受体序列如SEQNO:5所示；其中，在CD28序列和4-1BB功能区序列的组合中，CD28序列位于4-1BB功能区序列的N端。在一些实施例中，所述共刺激信号结构域为突变的CD28序列和4-1BB功能区序列的组合；其中，突变的CD28为将CD28中四个连续的氨基酸突变为YMNM突变成AAAA得到的；所述的嵌合抗原受体序列如SEQNO:6所示。在一些实施例中，所述共刺激信号结构域为CD28序列和4-1BB功能区序列的组合；所述的嵌合抗原受体序列如SEQNO:7所示；其中，4-1BB功能区序列位于CD28序列的N端。第二方面，提供了一种嵌合抗原受体表达载体，包括编码第一方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸。第三方面，提供了一种表达第一方面所述的嵌合抗原受体的T细胞。第四方面，提供了第三方面所述的T细胞在制备抗肿瘤药物中的用途。在一个实施例中，所述肿瘤为血液肿瘤；所述血液肿瘤包括以下任一种：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤。第五方面，提供了一种抗肿瘤药物，包括第三方面所述的载体或第一方面所述的T细胞。在一个实施例中，所述肿瘤为血液肿瘤；所述血液肿瘤包括以下任一种：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤。本申请提供的嵌合抗原受体包含了两个共刺激信号序列突变体的CAR在体外的增殖能力更强，为临床上治疗白血病提供新的肿瘤细胞药物，也为临床上用嵌合抗原疗法治疗实体瘤提供新的设计思路。本申请改造了嵌合抗原受体的共刺激信号结构域，可刺激T细胞快速增殖，并且延长了T细胞在体内的存续时间，从而可改善肿瘤治疗效果，降低肿瘤的复发率。附图说明图1a为本申请实施例提供的一种CD28和4-1BB全长序列的组合的示意图；图1b为本申请实施例提供的一种CD28和4-1BB功能区的组合的示意图；图1c为本申请实施例提供的一种CD28和4-1BB功能区的组合的示意图；图1d为本申请实施例提供的一种CD28和4-1BB功能区的组合的示意图；图2为包含本申请实施例提供的嵌合抗原受体的编码核苷酸序列的PUC57载体上的结构示意图；图3为T细胞表达本申请实施例提供的嵌合抗原受体的结果展示图；图4为T细胞增殖情况展示图。具体实施方式下面通过附图和实施例，对本申请的技术方案做进一步的详细描述。嵌合抗原受体T细胞(chimericantigenreceptorgene-modifiedTcell，CAR-T)技术是一种新型的癌症治疗手段。CAR-T细胞是将融合有CAR基因的核酸导入到自体或异体T淋巴细胞基因组中构建而成。嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)的发展经历了不同阶段。第一代CAR不具有共刺激信号结构域，因而CAR-T细胞的增殖效应较少，抗肿瘤效果不佳。第二代CAR含有单个共刺激信号结构域的CAR。共刺激信号结构域是指存在于抗原提呈细胞表面，能与T细胞上的共刺激分子受体结合，产生协同刺激信号的结构域。共刺激信号结构域一般有CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、B7-H3等。含有不同共刺激信号结构域的CAR各有优缺点，有的可以刺激CAR-T细胞在体内迅速扩增，但同时也使得CAR-T细胞迅速耗竭，肿瘤复发率较高；有的虽然使得CAR-T在体内存续时间更长，但是其刺激CAR-T细胞扩增较慢，同样导致治疗效果不佳。已有的第三代CAR的共刺激信号结构域由两个共刺激因子组成，但疗效仍不佳，其原因在于已有的第三代CAR的设计不够优化。本申请实施例提供了一种包含CD28和4-1BB的功能区的CAR，不但可刺激T细胞快速增殖，还可延长了T细胞在体内的存续时间，从而可改善肿瘤治疗效果，降低肿瘤的复发率。在本申请实施例中，“核酸”或“核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其DNA或RNA的组合及其聚合物，所述的核酸分子是合成的或重组的。“表达载体”是指包括重组核苷酸的载体，所述重组核苷酸包括与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列。表达载体包括足以用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)等等。“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属，慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞，可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体中最有效的方法之一，如HIV、SIV和FIV等均属于慢病毒。接下来，在各实施例中对本申请实施例提供的CAR进行具体介绍。在进一步描述本申请具体实施方式之前，应理解，本申请的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本申请实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本申请的保护范围；在本申请说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本申请另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本申请中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
的技术人员对现有技术的掌握及本申请的记载，还可以使用与本申请实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本申请。除非另外说明，本申请中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体，包括，肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、胞内的共刺激信号结构域、信号转导结构域；其中，所述共刺激信号结构域包括CD28和4‑1BB功能区，所述4‑1BB功能区包括QEED和EEEE。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，包括，肿瘤抗原结合结构域、胞外铰链及跨膜结构域、胞内的共刺激信号结构域、信号转导结构域；其中，所述共刺激信号结构域包括CD28和4-1BB功能区，所述4-1BB功能区包括QEED和EEEE。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述肿瘤抗原结合结构域包括靶向CD19的单链抗体，所述靶向CD19的单链抗体的序列如SEQNO:1所示；所述胞外铰链及跨膜结构域包括CD28胞外铰链及跨膜结构域；所述信号转导结构域包括CD3ζ，所述CD3ζ的序列如SEQNO:3所示。3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述共刺激信号结构域为CD28序列和4-1BB全长序列的组合；所述的嵌合抗原受体序列如SEQNO:4所示。4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述共刺激信号结构域为CD28序列和4-1BB功能区序列的组合；所述的嵌合抗原受体序列如SEQNO:5所示；其中，在C...

【专利技术属性】
技术研发人员：王甜，
申请(专利权)人：杭州普科亭生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33