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植物生产人胰岛素与转铁蛋白长效口服降糖胶囊的应用制造技术

技术编号:22153888 阅读:22 留言:0更新日期:2019-09-21 05:49
本发明专利技术涉及生物技术领域,特别涉及植物生产人胰岛素与转铁蛋白长效口服降糖胶囊的应用。本发明专利技术利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台,利用简单以及高效的表达体系生产生物活性物质。随后将生产该活性物质的叶片冻干制成胶囊。此胶囊可以在常温保存而保持生物活性。利用Western Blot蛋白杂交法确定降糖活性蛋白成功表达。生物活性测试结果表明利用该平台技术生产的降糖胶囊显著降低了狗血液中的血糖浓度。

Application of long-acting oral hypoglycemic capsules of plant-producing human insulin and transferrin

【技术实现步骤摘要】
植物生产人胰岛素与转铁蛋白长效口服降糖胶囊的应用
本专利技术涉及生物
,特别涉及植物生产人胰岛素与转铁蛋白长效口服降糖胶囊的应用。
技术介绍
糖尿病是由于胰岛素绝对缺乏或相对不足以及靶组织细胞(如脂肪、肝脏、骨骼肌等)对胰岛素敏感性降低(胰岛素抵抗)而引起的以慢性血糖水平升高为特征的代谢异常综合症,可导致糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱。临床上主要有胰岛素依赖型(IDDM,I型)和非胰岛素依赖型(NIDDM,II型)两种类型。糖尿病作为一种严重的非传染性慢性疾病现已成为全世界各国密切关注的重大公共卫生问题之一,是全球范围内继心血管和肿瘤疾病之后的第三号杀手。随着生活水平提高,无论在发达国家还是在发展中国家,糖尿病的发病率都在逐年上升。在发展中国家表现更为突出。据WHO估计,全球目前糖尿病患者已超过1.9亿,到2025年将增加到3亿。20世纪80年代,人们通过基因工程(重组DNA)(转基因)酵母(啤酒酵母.毕赤酵母或汉逊酵母)或重组中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达出高纯度的合成人胰岛素,其结构和人体自身分泌的胰岛素一样。对比动物胰岛素,人胰岛素较少发生过敏反应或者胰岛素抵抗,所以皮下脂肪萎缩的现象也随之减少;由于人胰岛素抗体少,所以注射量比动物胰岛素平均减少30%;人胰岛素的稳定性高于动物胰岛素,常温25℃左右常温可保存人胰岛素4周。在起效时间、峰值时间、作用持续时间上不能模拟生理性人胰岛素分泌模式。需在餐前30分钟注射、有较高的夜间低血糖风险。20世纪90年代末,在对人胰岛素结构和成分的深入研究中发现,对肽链进行修饰:利用基因工程技术,改变胰岛素肽链上某些部位的氨基酸组合;改变等电点;增加六聚体强度;以钴离子替代锌离子;在分子中增加脂肪酸链,加大与白蛋白的结合,均有可能改变其理化和生物学特征,从而可研制出更适合人体生理需要的胰岛素类似物(insulinsimilitude)。胰岛素类似物可紧临餐使用,也称为餐时胰岛素或速效胰岛素。尽管胰岛素在治疗糖尿病上有诸多优点,但它由于多肽类药物本身的性质以及人体对其产生的各种屏障,其常规给药途经一直以注射为主。本专利技术将人胰岛素与转铁蛋白融合表达,可以实现在口服给药,减轻病患长期频繁注射带来的痛苦。
技术实现思路
有鉴于此,本专利技术提供一种植物生产人胰岛素与转铁蛋白长效口服降糖胶囊的应用。本专利技术对具有降糖作用的活性多肽进行结构改造和修饰,使其获得可通过肠道进行吸收并在体内达到有效治疗浓度的特性,并通过植物来生产该活性物质。本专利技术利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术,表达了人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白序列。并且制成口服降糖胶囊。为了实现上述专利技术目的,本专利技术提供以下技术方案:本专利技术提供了人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白,其具有:(Ⅰ)、如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列;或(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列,且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列;或(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有80%同源性的氨基酸序列。本专利技术还提供了编码如权利要求1所述融合蛋白的核苷酸,具有(Ⅰ)、如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列;或(Ⅱ)、如SEQID2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列;或(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质,但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列;或(IV)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列,且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列;或(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(IV)所述核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列。在上述研究基础上,本专利技术还提供了表达载体,包括所述的核苷酸以及待转化载体。在本专利技术的一些具体实施方案中,所述待转化载体为叶绿体表达载体。本专利技术还提供了所述的表达载体的构建方法,包括如下步骤:步骤1:分别将所述人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白的密码子优化为植物偏好的密码子,其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示;步骤2:将所述核苷酸序列克隆到pUC57载体中,获得pInTf。本专利技术还提供了所述的表达载体或植物在表达人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白或制备包含所述融合蛋白的药物中的应用;所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草;所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。在本专利技术的一些具体实施方案中,所述药物为降糖的口服制剂。在上述研究的基础上,本专利技术还提供了宿主,转化有所述表达载体的植物或微生物;所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草;所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。本专利技术还提供了药物,包括所述的融合蛋白以及药学上可接受的辅料。在本专利技术的一些具体实施方案中,所述药物为降糖的口服制剂。本专利技术还提供了一种植物作为宿主表达人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白的方法,将所述的表达载体用基因枪轰击叶片,在植物叶绿体中表达后获得再生植株,将植物叶片冻干粉碎、提取,获得人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白。在本专利技术的一些具体实施方案中,所述基因枪轰击包括如下步骤:步骤1:准备转化用载体;步骤2:准备微粒子弹;步骤3:基因枪轰击;步骤4:转换后培养、再生为植株。本专利技术还提供了一种植物作为宿主制备降糖的药物的方法,将所述的表达载体用基因枪轰击叶片,在植物叶绿体中表达后获得再生植株,将植物叶片冻干粉碎、提取,获得人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白,灌装。在本专利技术的一些具体实施方案中,所述基因枪轰击包括如下步骤:步骤1:准备转化用载体;步骤2:准备微粒子弹;步骤3:基因枪轰击;步骤4:转换后培养、再生为植株。植物叶绿体表达技术是利用基因枪轰击、同源重组的方式将含有目标蛋白的质粒转移到植物叶绿体中,获得该基因植物叶绿体中高效表达的技术。与动物细胞表达系统相比,植物表达系统的成本非常低,仅为其千分之一到千分之二。本专利技术利用植物叶片,生产口服降糖胶囊。该降糖产品不需要注射,减轻病患的痛苦。生菜不含有植物有毒物质,而且本产品不需蛋白纯化流程,可以大大缩短生产周期和生产成本。本专利技术通过实验发现,植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台,叶绿体可以高效的表达活性蛋白。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产,因此比其它植物,如烟草等更容易获得并且更便宜,并且由于不需要复杂的特殊生产设备,成本可显著降低。综上所述,本专利技术可以利用生菜系统大规模生产人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白序列。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示载体pInTf示意图;图2示western-blot结果。具体实施方式本专利技术公开了一种植物生产人胰岛素与转铁蛋白长效口服降糖胶囊的应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本专利技术技术。本发本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白,其特征在于,其具有:(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列;或(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列,且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列;或(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有80%同源性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.人胰岛素与转铁蛋白的融合蛋白,其特征在于,其具有:(Ⅰ)、如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列;或(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列,且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列;或(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有80%同源性的氨基酸序列。2.编码如权利要求1所述融合蛋白的核苷酸,其特征在于,具有(Ⅰ)、如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列;或(Ⅱ)、如SEQID2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列;或(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质,但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列;或(IV)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列,且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列;或(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(IV)所述核苷酸序列至少有80%同源性的核苷酸序列。3.表达载体,其特征在于,包括如权利要求2所述的核苷酸以及待转化载体。4....

【专利技术属性】
技术研发人员:王跃驹
申请(专利权)人:王跃驹
类型:发明
国别省市:美国,US

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