一种长效重组人生长激素融合蛋白及其工程细胞制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，特别是基因重组长效人生长激素技术领域，具体涉及一种长效重组人生长激素融合蛋白及其工程细胞，本发明专利技术的长效重组人生长激素融合蛋白rhGH‑Fc可以延长血清半衰期，增加蛋白在体内的生物活性，降低蛋白的免疫原性，从而改善药效，大大降低治疗时间内所需的注射给药频率，从而提高患者的依从性、增加医患双方的便利性；本发明专利技术构建的表达rhGH‑Fc的工程细胞具有蛋白表达量高、生物活性好的特点，特别适用于工业化大规模制备基因重组长效人生长激素。

A Long-acting Recombinant Human Growth Hormone Fusion Protein and Its Engineering Cells

【技术实现步骤摘要】
一种长效重组人生长激素融合蛋白及其工程细胞
本专利技术涉及基因工程
，特别是基因重组长效人生长激素
，具体涉及一种长效重组人生长激素rhGH-Fc融合蛋白、其工程细胞及构建和筛选方法。
技术介绍
人生长激素(HumanGrowthHormone,hGH)是人类出生后促生长最重要的一种蛋白质类激素，其具有种属特异性，由人脑垂体前叶的嗜酸性细胞分泌，人生长激素的蛋白受体遍及全身各个部位，而并不是通过靶腺作用来产生生理学效应。人生长激素含有191个氨基酸分子，其中大部分是以分子量22KDa形式存在，等电点为4.9，在第53位的半胱氨酸与165位的半胱氨酸之间的以及第182位的半胱氨酸与189位半胱氨酸之间存在两个二硫键，少量生长激素以20KDa形式存在。生长激素最主要的生理作用是通过促进身体各组织、器官以及骨骼中受体细胞的蛋白质合成和脂肪的分解，进而促进人的代谢和生长发育。若生长激素分泌不足会导致生长停滞及身体各功能紊乱，若分泌过多会引起不良反应，如出现“肢端肥大”、“巨人症”等。人生长激素最为明显的作用是增强蛋白质的合成、增强胶原蛋白的合成、促进骨组织的发育。虽然hGH对维持骨的生长十分重要，但是在骨生长中生长激素并非起直接作用，它是通过刺激血液中的硫化因子(SM)来实现的，SM可以促进身体内各种组织细胞及母细胞的分裂。人生长激素还可以促进氨基酸进入细胞中，减少氨类物质、含氮类物质的排出，保持机体的代谢状态平衡。人生长激素还能促使脂肪分解作用，抑制葡萄糖的氧化作用，减慢葡萄糖的消耗速度，还具有稳定糖原的作用。目前生长激素仍是一种非常复杂的激素，许多功能还有待研究。人生长激素在临床上主要用于儿童生长激素缺乏症，Tuner综合症，促进大面积烧伤创面的愈合等。目前在中国，儿童生长发育迟缓发生率高达9.9％，居全球第二。根据中华医学会统计，目前全国4～15岁矮小患儿总数约有700万人，按其中的1/3为生长激素缺乏症推算，国内需要用生长激素治疗的儿童大概有200万，但能够接受合理治疗人数目前仍不到3万人。对患者进行长期的随访时发现：约23％的儿童患者每个月会漏打三针以上；近13％的患者儿童会漏打处方剂量的一半以上；临床证据表明，没有严格遵守治疗方案患者可达50％以上。主要的原因是目前普通的重组人生长激素需要每日注射一次，以保持适当的血清生长激素水平。患者十分痛苦，治疗依从性差，并且价钱昂贵。对于那些需要长期接受生长激素治疗的病人，往往由于不能按时注射，造成治疗效果降低。目前在国内，重组人生长激素被批准的适应症主要有2种，其中大部分应用于治疗儿童“矮小症”，目前国内儿童矮小症患者治疗率很低，所以长效、高活性的重组人生长激素具有较大的未来市场潜力。目前用于表达蛋白药物的表达系统分为两类，最早使用的是原核表达系统，主要为大肠杆菌。另一类为真核表达系统，昆虫、酵母、哺乳动物细胞均属此类表达系统。虽然大肠杆菌细胞具有良好的可操作性，成本相对较低，但是往往不能进行正确的糖基化修饰，在胞内容易形成包涵体。目前，国内的公司大多采用大肠杆菌分泌表达技术生产生长激素，其蛋白含有内毒素，需要繁琐的纯化步骤去除，致使最终产品收率较低，由于大肠杆菌是原核表达载体，所以目的蛋白的活性也较低。CHO细胞(仓鼠卵巢细胞，ChineseHamsterOvary)属于真核细胞，具有转录修饰功能和蛋白质的翻译后修饰功能，表达的目的蛋白的构象、分子结构、理化特性、生物学功能都与天然的蛋白质十分接近。CHO细胞是成纤维细胞的一种，其自身的内源蛋白分泌量极少，对于后期重组蛋白的分离纯化十分有利；在培养方面，CHO细胞既具有贴壁生长的特性，若经驯化，也可进行悬浮培养，耐受较大剪切力和渗透压的能力较好；无血清培养可以提高产品的纯度，方便产物的分离纯化，同时可以减小由于血清带来的污染及过敏源，还可以延长细胞的G1期或G0期，从而提高目的蛋白表达量，也为后期大规模工业生产提供便利。目前，国内商品化的长效生长激素均为PEG化生长激素，PEG化其能够增大蛋白分子量，不易通过肾小球，降低清除速率，防止蛋白酶的酶解作用，从而延长药物在体内的半衰期，但蛋白质聚乙二醇化过程会损失生物活性。目前研究最热，发展最迅速的长效蛋白药物技术为Fc融合蛋白技术，Fc片段是IgG保持体内较长半衰期的主要因素，同时可以稳定蛋白，现已用于多种融合蛋白的开发。Fc片段通过两种机制发挥功能，第一种是与细胞表面的Fc受体结合，通过吞噬或裂解作用杀伤细胞并通过抗体依赖性细胞毒(ADCC)途径消化病原体。在四种人IgG亚型中IgG1与IgG3能有效的结合细胞表面的Fc受体，而IgG2和IgG4与受体结合的亲和力较低。第二种是与第一补体成分C1的C1q结合，通过补体依赖的细胞毒(CDC)途径裂解病原体。人IgG1和IgG3能有效的结合C1q从而介导补体级联反应，人IgG2与C1q的结合能力较弱，而人IgG4不与C1q结合。Fc融合蛋白主要是为了增加蛋白药物在体内的半衰期和简化生产工艺降低成本，Fc介导的IgG效应和裂解细胞的功能并不是必要的，甚至会产生副作用，基于以上原因选择IgG4亚型并进行相应的氨基酸突变以减弱其效应分子的功能。Fc融合蛋白技术不仅如PEG化般增大蛋白药物分子质量降低清除率，更加也能通过FcRn结合域，通过pH敏感性结合力以缓释的方式延长半衰期。目前的许多研究均表明，Fc融合蛋白具有比PEG化药物有更长的半衰期。具体到人生长激素，已有对其融合Fc片段的数项研究，以CN102875683B为例，其公开了一种长效重组人生长激素Fc融合蛋白hGH-L-vFc融合蛋白，含有人生长激素、约2-20个氨基酸的柔性肽接头、和人IgGFc变体，所述人IgGFc变体可以选自含有S228P和L235A突变的人IgG4铰链区、CH2和CH3区域。但上述数项研究中，对于人生长激素半衰期延长效果并不令人满意。因此，仍进一步需要开发更加长效、高活性的人生长激素衍生物。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种长效重组人生长激素rhGH-Fc融合蛋白，所述融合蛋白由人生长激素、连接肽和Fc片段组成；由N端至C端依次为：人生长激素、连接肽、Fc片段，其氨基酸序列共431个氨基酸，其中前191个氨基酸序列为人生长激素序列，第192位至第206位为连接肽序列，第207位至第431位为人IgG的Fc片段。进一步地，所述Fc片段选自人IgG的Fc片段，优选为人IgG4的Fc片段。进一步地，所述人IgG4的Fc片段包括四个氨基酸突变，所述氨基酸突变为：S228P、F234A、L235A和V308P，其中IgGFc区中的残基的编号是依据KabatEuIndex编号。其中，S228P位点突变是为了维持蛋白的稳定性；F234A及L235A位点突变是为了减低免疫融合蛋白与Fc受体的亲和力从而达到降低免疫融合蛋白的ADCC活性的作用；而V308P位点突变使融合蛋白与FcRn的结合呈pH依赖，故可通过提高蛋白分子量从而不被肾小球滤过和V308P位点的突变从而使蛋白呈pH依赖两个方面，使长效重组人生长激素rhGH-Fc免疫融合蛋白的半衰期高于普通Fc融合蛋白药物。进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种长效重组人生长激素rhGH‑Fc融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白由人生长激素、连接肽和Fc片段组成；所述融合蛋白由N端至C端依次为：人生长激素、连接肽、Fc片段，其氨基酸序列共431个氨基酸，其中前191个氨基酸序列为人生长激素序列，第192位至第206位为连接肽序列，第207位至第431位为人IgG的Fc片段。

【技术特征摘要】
1.一种长效重组人生长激素rhGH-Fc融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白由人生长激素、连接肽和Fc片段组成；所述融合蛋白由N端至C端依次为：人生长激素、连接肽、Fc片段，其氨基酸序列共431个氨基酸，其中前191个氨基酸序列为人生长激素序列，第192位至第206位为连接肽序列，第207位至第431位为人IgG的Fc片段。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述Fc片段选自人IgG的Fc片段，优选为人IgG4的Fc片段。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白Fc片段包括四个氨基酸突变，所述氨基酸突变为：S228P、F234A、L235A和V308P，其中IgGFc区中的残基的编号是依据KabatEuIndex编号。4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。5.权利要求1至4任一项所述融合蛋白的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。6.一种工程细胞，其特征在于：所述工程细胞表达权利要求1至4任一项所述的融合蛋白。7.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体优选为双表达载体；更优选地，所述表达载体为以双表达质粒p327.8GS经限制性内切酶Hi...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘景会，刘涵，俞露，刘琳琳，刘玉林，张宇，薛毅勇，郭胜仓，许佳慧，
申请(专利权)人：长春生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22