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一种RHC-(RADA)4融合蛋白制造技术

技术编号:22153874 阅读:31 留言:0更新日期:2019-09-21 05:49
本发明专利技术公开了一种RHC‑(RADA)4融合蛋白,该融合蛋白的基因序列由以下两部分组成:RHC基因序列和(RADA)4基因序列。本发明专利技术的RHC‑(RADA)4融合蛋白在国内外尚属首次,其优点为:(1)RHC‑(RADA)4融合蛋白为基因工程直接表达产物,解决了低分子量(RADA)4通过化学合成导致成本高的问题。(2)获得的RHC‑(RADA)4融合蛋白较单纯使用RHC具有更优异的止血效果。

A RHC - (RADA) 4 fusion protein

【技术实现步骤摘要】
一种RHC-(RADA)4融合蛋白
本专利技术涉及生物医学材料领域,特别涉及一种RHC-(RADA)4融合蛋白。
技术介绍
治疗战争和外科创伤所导致的不可控出血是全球关注的热点,这种不可控出血造成的死亡率达30%以上,其中半数以上发生在未做急救护理之前。因此,使用止血材料快速有效地控制出血是非常重要的创伤急救措施。自组装肽(RADA)4是化学合成的强效止血材料,能够在15s内终止成年仓鼠脑、脊髓、股动脉和肝等部位的创伤出血,其生物可降解,降解产物氨基酸机体可利用,无病原风险。但合成、纯化价格昂贵,应用范围极大受限。当前,低成本获取药用蛋白的首选方法是基因工程发酵。但是,(RADA)4相对分子量偏低,即使利用基因工程技术在宿主细胞中过表达,也因稳定性太差而难以获得理想的浓度水平。提高(RADA)4在宿主细胞中的稳定性是实现基因工程法生产(RADA)4的关键。类人胶原蛋白是根据胶原蛋白多肽链中“Gly-Pro-Hyp”、或“Gly-Pro-Xaa”和“Gly-Xaa-Yaa”(Xaa、Yaa代表Gly和Pro以外的任何氨基酸)的重复序列,通过基因工程技术获得的具有胶原蛋白特性的蛋白质。RHC(RecombinantHumanCollagen,重组人胶原蛋白)海绵除具有动物胶原蛋白的生物特性外,还具有高孔隙率、高弹性模量、加工性能好、且无病毒隐患和排异反应低等优点。类人胶原蛋白已被证实可应用于皮肤护理,药物递送,止血海绵,包裹改性纳米微球,皮肤缺损修复,组织工程血管支架,组织工程软骨及骨研究等,充分表明了类人胶原蛋白优异的生物相容性。但目前尚未有将RHC与(RADA)4复合的报道。
技术实现思路
为解决上述问题,本专利技术的目的是提供一种利用基因工程技术制备的RHC-(RADA)4融合蛋白,该融合蛋白为基因工程直接表达产物,解决(RADA)4只能通过化学合成导致成本高、不能稳定性表达的问题。为解决上述技术问题,本专利技术采用如下技术方案予以实现:一种RHC-(RADA)4融合蛋白,该融合蛋白的基因序列由以下两部分组成:RHC基因序列和(RADA)4基因序列,该融合蛋白的基因序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示。本专利技术还具有如下区别技术特征:所述融合蛋白的制备方法,包括以下步骤:步骤一、合成RHC-(RADA)4编码基因,并保存于克隆载体;步骤二、通过核苷酸限制性内切酶切割、核酸琼脂糖凝胶电泳和目的片段切胶回收,将RHC-(RADA)4融合蛋白的编码基因插入线性化表达载体,经转化和重组子筛选鉴定,获得RHC-(RADA)4融合蛋白表达载体;步骤三、实现RHC-(RADA)4融合蛋白在宿主细胞中的过表达;步骤四、纯化过表达产物RHC-(RADA)4融合蛋白,干燥保存。所述步骤一中,RHC的序列(Gly-Xaa-Yaa)n中的n可以是任一数字,其中Xaa、Yaa为Gly以外的任何氨基酸。所述步骤二中,将RHC-(RADA)4融合蛋白的编码基因插入线性化表达载体包括:采用细菌表达时,将RHC-(RADA)4编码基因插入线性化的原核表达载体的相应位点,经细菌转化和重组子筛选鉴定,获得一系列氨基酸组成和肽链长度不同的RHC-(RADA)4表达载体;采用真核表达时,将RHC-(RADA)4编码基因的克隆载体线性化,转化真核细胞和重组子筛选鉴定,获得一系列氨基酸组成和肽链长度不同的RHC-(RADA)4表达载体。所述步骤二中,用于保存RHC-(RADA)4融合蛋白的克隆菌株为原核细胞或真核细胞。所述步骤三中,实现RHC-(RADA)4融合蛋白在宿主细胞中的过表达包括:采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳确定RHC-(RADA)4融合蛋白为可溶性表达还是包涵体表达,对可溶性表达收集上清,对包涵体表达收集沉淀后用盐酸胍或尿素溶解。所述步骤四中,纯化表达产物RHC-(RADA)4融合蛋白包括:确定RHC-(RADA)4融合蛋白等电点后采用阴/阳离子交换层析或反相色谱法进行纯化。上述的RHC-(RADA)4融合蛋白用于提高(RADA)4在宿主细胞中的稳定性。本专利技术的有益效果是:本专利技术提出了一种提高(RADA)4在宿主细胞中稳定性的新思路,不同于目前的研究热点(通过研究(RADA)4本身来解决其在宿主细胞中的稳定性问题),本专利技术是将(RADA)4与其他蛋白融合表达,通过提高其共同表达产物的稳定性来达到间接提高(RADA)4在宿主细胞稳定性的目的。本专利技术首次将RHC与(RADA)4融合,获得的RHC-(RADA)4融合蛋白能实现稳定性表达,且表达不受复合的影响。本专利技术还同时获得了以下效果:(1)RHC-(RADA)4融合蛋白为基因工程直接表达产物,解决(RADA)4只能通过化学合成导致成本高的问题。(2)获得的RHC-(RADA)4融合蛋白相比于(RADA)4具有更优异的止血效果。附图说明图1为实施例3:XhoI和NotI双酶切检测RHC-RADA编码基因在pPIC9K中的克隆。M:DNAMarkerIII;1-2:pPIC9K-RHC-(RADA)4质粒。图2为实施例3:SalI单酶切线性化pPIC9K-RHC-(RADA)4质粒后,核酸电泳检测线性化结果。M:DNALadderMix;1:未线性化pPIC9K-RHC-(RADA)4质粒;2:线性化pPIC9K-RHC-(RADA)4质粒。图3为实施例3:线性化pPIC9K-RHC-(RADA)4质粒电转入酵母,提取酵母基因组,检测电转效率,以提取基因组为模板,用RHC-(RADA)4序列中的一段设计引物然后PCR,核酸电泳,筛选导入pPIC9K-RHC-(RADA)4的酵母菌株。M:DNALadderMix;1-23:导入pPIC9K-RHC-(RADA)4酵母菌株的基因组PCRRHC-(RADA)4部分基因。其中1、7、8、11、12、14、16、19-22号菌株基因组中有RHC-(RADA)4部分基因。图4为实施例3:挑选了7株酵母菌表达菌株,SDS-PAGE结果表明7株酵母菌中1、4、6、7可表达RHC-(RADA)4融合蛋白(分子量52kD)。M:蛋白分子量Marker;1-7:诱导菌株上清。图5为实施例3所获得的RHC-(RADA)4融合蛋白纯化过程,通过阳离子交换色谱纯化,收集图谱中出峰时的洗脱液做SDS-PAGE确定纯化工艺。通过阳离子交换色谱法获得纯度达到95%以上的RHC-(RADA)4融合蛋白。图6为实施例3所获得的RHC-(RADA)4融合蛋白形貌观察及血小板粘附后形貌观察(a,b)RHC和(c,d)RHC-(RADA)4大体形貌观察;(e,f)RHC和(g,h)RHC-(RADA)4的SEM形貌观察,RHC为多孔结构,RHC-(RADA)4为纤维结构;(i,j)RHC和(k,l)RHC-(RADA)4孵育富血小板血浆1小时后的SEM形貌观察。RHC表面未观察到血小板,RHC-(RADA)4表面观察到血小板,且部分血小板伸出伪足。图7为实施例3所获得的RHC-(RADA)4融合蛋白用于小鼠肝脏破裂止血实验过程(a)RHC(b)RHC-(RADA)4(c)RHC物理复合(RADA)4。RHC已被血液浸透,而RHC-(RADA)4材本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种RHC‑(RADA)4融合蛋白,其特征在于,该融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。

【技术特征摘要】
1.一种RHC-(RADA)4融合蛋白,其特征在于,该融合蛋白的基因序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示。2.如权利要求1所述融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白的制备方法,包括以下步骤:步骤一、合成RHC-(RADA)4编码基因,并保存于克隆载体;步骤二、将RHC-(RADA)4编码基因插入线性化表达载体,经转化和重组子筛选鉴定,获得RHC-(RADA)4融合蛋白表达载体;步骤三、实现RHC-(RADA)4融合蛋白在宿主细胞中的过表达;步骤四、纯化过表达产物RHC-(RADA)4融合蛋白,干燥保存。3.如权利要求2所述融合蛋白,其特征在于,步骤一RHC-(RADA)4编码基因中,RHC的序列为(Gly-Xaa-Yaa)n,其中,n可以是任一数字,Xaa、Yaa为Gly以外的任何氨基酸。4.如权利要求2所述融合蛋白,其特征在于,所述步骤二中,通过核苷酸限制性内切酶切割、核酸琼脂糖凝胶电泳和目的片段切胶回收,将RHC-(RADA)4编码基因插入线性化表达载体,经转化和重组子筛选鉴定,获得RHC-(RADA)4融合蛋白表达载体。5.如权利要求2所述融合蛋白,其特征在于,将RHC-(RADA)4融合蛋白的编码基因插...

【专利技术属性】
技术研发人员:陈卓玥陈富林侯增淼梁强赵金礼
申请(专利权)人:西北大学陕西慧康生物科技有限责任公司
类型:发明
国别省市:陕西,61

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