具有交换结合区取向的双重可变区抗体样结合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及具有交换结合区取向的双重可变区抗体样结合蛋白，具体地提供包含形成4个抗原结合位点的4条多肽链的抗体样结合蛋白，其中形成抗体样结合蛋白的每对多肽具有带有交换取向的双重可变结构域。本发明专利技术还提供用于制备这类抗原样结合蛋白的方法。

Double variable region antibody-like binding protein with exchange binding region orientation

【技术实现步骤摘要】
具有交换结合区取向的双重可变区抗体样结合蛋白本专利技术申请是基于申请日为2012年03月28日，申请号为201280025960.2(国际申请号为PCT/US2012/030948)、名称为“具有交换结合区取向的双重可变区抗体样结合蛋白”的专利技术专利申请的分案申请。专利
本专利技术涉及包含形成4个抗原结合位点的4条多肽链的抗体样结合蛋白，其中形成抗体样结合蛋白的每对多肽具有带有交换取向的双重可变结构域。本专利技术还涉及用于制备这类抗原样结合蛋白的方法。专利技术背景天然存在的IgG抗体是二价和单特异性的。对两种不同的抗原具有结合特异性的双特异性抗体可采用重组技术产生，并预期具有广泛的临床应用。众所周知，完整的IgG抗体分子是Y形分子，包含4条多肽链：2条重链和2条轻链。每条轻链由2个结构域组成，称为可变或VL结构域(或区)的N端结构域和称为恒定(或CL)结构域(恒定κ(Cκ)或恒定λ(Cλ)结构域)的C端结构域。每条重链由4或5个结构域组成，这取决于抗体的类别。N端结构域称为可变(或VH)结构域(或区)，其后面是第一恒定(或CH1)结构域、铰链区，然后是第二和第三恒定(或CH2和CH3)结构域。在装配的抗体中，VL和VH结构域缔合在一起形成抗原结合位点。此外，CL和CH1结构域缔合在一起以保持一条重链与一条轻链缔合。两个重链-轻链异二聚体通过CH2和CH3结构域的相互作用和两条重链上铰链区之间的相互作用缔合在一起。已知抗体的蛋白水解消化可导致抗体片段(Fab和Fab2)的产生。完整抗体的这类片段可显示抗原结合活性。抗体片段还可重组产生。可获得Fv片段，其由彼此缔合的重链和轻链的可变结构域组成。这些Fv片段对于抗原结合是一价的。较小的片段，例如单独的可变结构域(结构域抗体或dAB；Ward等,1989,Nature341(6242):544-46)和单独的互补决定区或CDR(Williams等,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(14):5537-41)也显示保持亲本抗体的结合特性，但是大多数天然存在的抗体一般需要VH和VL两者以保持完整的结合效能。单链可变片段(scFv)构建体包含单一多肽链中所包含的抗体VH和VL结构域，其中结构域被足够长(大于12个氨基酸残基)的柔性接头分隔，所述接头迫使分子内相互作用，允许两个结构域自我装配成功能性表位结合位点(Bird等，1988，Science242(4877):423-26)。这些小的蛋白质(MW约25,000Da)一般在单个多肽中保持对其抗原的特异性和亲和力，并可为较大的抗原特异性分子提供合适的结构单元(buildingblock)。在诊断和治疗中使用抗体片段而非完整抗体的优势在于其较小的尺寸。它们可能比完整抗体较低免疫原性，并且更能够渗透组织。与使用这类片段有关的缺点是，它们只有一个抗原结合位点，导致亲合力降低。另外，由于其尺寸小，它们非常快地从血清中清除，因此显示短的半寿期。一直感兴趣的是产生双特异性抗体(BsAb)，其将两种抗体的抗原结合位点组合在单一分子内，因此，总能够同时结合两种不同的抗原。除诊断目的的应用以外，这类分子还例如通过将有效的效应器系统重定向至患病区(其中癌细胞通常发展抑制由单克隆抗体引发的正常免疫应答的机制，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC))或通过提高抗体的中和或刺激活性，为新的治疗应用做好准备。这种潜力在早期就被认可，产生了多种用于获得这类双特异性抗体的方法。将针对不同靶抗原的两个完整抗体的结合特异性连接起来用于治疗目的的最初尝试利用了化学融合的异型缀合(heteroconjugate)分子(Staerz等，1985，Nature314(6012):628-31)。双特异性抗体最初通过融合两种杂交瘤来制备，每种杂交瘤能够产生不同免疫球蛋白(Milstein等，1983，Nature305(5934):537-40)，但在细胞培养中产生的种类的复杂性(多达10个不同的种类)使得纯化困难并昂贵(George等，1997，TheAntibodies4:99-141(Capra等主编，HarwoodAcademicPublishers))。采用这种形式，在相同细胞(例如，作为两种杂交瘤的四源杂交瘤(quadroma)融合，或在工程改造的CHO细胞)中同时产生小鼠IgG2a和大鼠IgG2b抗体。由于每种抗体的轻链优先与其同源类型的重链缔合，因此装配出3种主要类型的抗体：两种亲代抗体和包含各自的一个重链/轻链对(通过其Fc部分缔合)的两种抗体的异二聚体。所需的异二聚体可从这种混合物中纯化，因为其与蛋白A的结合性质不同于亲代抗体的结合性质：大鼠IgG2b不与蛋白A结合，而小鼠IgG2a则结合。因此，小鼠-大鼠异二聚体与蛋白A结合，但在比小鼠IgG2a同二聚体高的pH下洗脱，这使得双特异性异二聚体的选择性纯化成为可能(Lindhofer等，1995，J.Immunol.155(1):219-25)。所得双特异性异二聚体完全是非人的，因此是高度免疫原性的，这可能具有有害的副作用(例如“HAMA”或“HARA”反应)，和/或抵消治疗性。存在对可易于以高收率从哺乳动物细胞培养中产生的具有优良性质的工程改造的双特异性的需要。尽管使用由上述细胞融合产生的异型缀合物或双特异性抗体所得到的有前景的结果，但若干因素使之对于大规模治疗应用不切实际。所述因素包括：异型缀合抗体在体内的快速清除、产生任何类型的分子所需要的实验室密集技术、对自同型缀合物或单特异性抗体中大量纯化出异型缀合物的需要以及通常获得的低收率。已利用遗传工程以渐增的频率来设计、修饰和产生具有所需要的成套结合性质和效应子功能的抗体或抗体衍生物。已开发出用于有效生产以下BsAb的各种重组方法：其作为抗体片段(Carter等,1995,J.Hematother.4(5):463-70；Pluckthun等,1997,Immunotechnology3(2):83-105；Todorovska等,2001,J.Immunol.Methods248(1-2):47-66)和全长IgG形式(Carter,2001,J.Immunol.Methods248(1-2):7-15)两者。组合两种不同的scFv导致具有最小分子量的BsAb形式，称为sc-BsAb或Ta-scFv(Mack等,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(15):7021-25；Mallender等,1994,J.Biol.Chem.269(1):199-206)。已通过将两种scFv遗传融合成二聚化官能团(例如亮氨酸拉链)，构建了BsAb(Kostelny等,1992,J.Immunol.148(5):1547-53；deKruif等,1996,J.Biol.Chem.271(13):7630-34)。双抗体(Diabodies)是小的二价和双特异性抗体片段。所述片段包含在相同多肽链上与VL连接的VH，其使用了太短以致于不允许相同链上的两个结构域配对的接头(小于12个氨基酸残基)。结构域被迫与另一条链的互补结构域进行分子间配对并产生两个抗原结合位点。这些二聚抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含形成4个抗原结合位点的4条多肽链的抗体样结合蛋白，其中2条多肽链具有由下式表示的结构：VL1‑L1‑VL2‑L2‑CL[I]并且2条多肽链具有由下式表示的结构：VH2‑L3‑VH1‑L4‑CH1‑Fc[II]其中：VL1为第一免疫球蛋白轻链可变结构域；VL2为第二免疫球蛋白轻链可变结构域；VH1为第一免疫球蛋白重链可变结构域；VH2为第二免疫球蛋白重链可变结构域；CL为免疫球蛋白轻链恒定结构域；CH1为免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；Fc为免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；和L1、L2、L3和L4为氨基酸接头；且其中式I的多肽和式II的多肽形成交换轻链‑重链对。

【技术特征摘要】
2011.11.14 FR 1160311;2011.03.28 US 61/468,2761.一种包含形成4个抗原结合位点的4条多肽链的抗体样结合蛋白，其中2条多肽链具有由下式表示的结构：VL1-L1-VL2-L2-CL[I]并且2条多肽链具有由下式表示的结构：VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc[II]其中：VL1为第一免疫球蛋白轻链可变结构域；VL2为第二免疫球蛋白轻链可变结构域；VH1为第一免疫球蛋白重链可变结构域；VH2为第二免疫球蛋白重链可变结构域；CL为免疫球蛋白轻链恒定结构域；CH1为免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；Fc为免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；和L1、L2、L3和L4为氨基酸接头；且其中式I的多肽和式II的多肽形成交换轻链-重链对。2.一种包含形成两个抗原结合位点的2条多肽链的抗体样结合蛋白，其中第一多肽链具有由下式表示的结构：VL1-L1-VL2-L2-CL[I]并且第二多肽链具有由下式表示的结构：VH2-L3-VH1-L4-CH1[II]其中：VL1为第一免疫球蛋白轻链可变结构域；VL2为第二免疫球蛋白轻链可变结构域；VH1为第一免疫球蛋白重链可变结构域；VH2为第二免疫球蛋白重链可变结构域；CL为免疫球蛋白轻链恒定结构域；CH1为免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；和L1、L2、L3和L4为氨基酸接头；且其中第一和第二多肽形成交换轻链-重链对。3.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1或2的抗体样结合蛋白的核苷酸序列。4.一种表达载体，其包含权利要求3的核酸分子。5.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求3的核酸分子或权利要求4的表达载体。6.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和治疗有效量的权利要求1或2的抗体样结合蛋白。7.一种用于制备权利要求1的抗体样结合蛋白的方法，所述方法包括在细胞中表达编码多肽的一种或多种核酸分子，所述多肽具有由下式[I]和式[II]表示的结构：VL1-L1-VL2-L2-CL[I]VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc[II]其中：VL1为第一免疫球蛋白轻链可变结构域；VL2为第二免疫球蛋白轻链可变结构域；VH1为第一免疫球蛋白重链可变结构域；VH2为第二免疫球蛋白重链可变结构域；CL为免疫球蛋白轻链恒定结构域；CH1为免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；Fc为免疫球蛋白铰链区和CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域；和L1、L2、L3和L4为氨基酸接头；且其中式I的多肽和式II的多肽形成交换轻链-重链对。8.一种用于制备权利要求2的抗体样结合蛋白的方法，所述方法包括在细胞中表达编码多肽的一种或多种核酸分子，所述多肽具有由下式[I]和式...

【专利技术属性】
技术研发人员：N鲍林，C贝尔，C科维，C兰格，D李，V米科尔，A施泰因梅茨，E劳，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：发明
国别省市：法国,FR