一种丝状支原体簇单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种丝状支原体簇单克隆抗体及其制备方法和应用，所述丝状支原体单克隆抗体通过支原体培养和免疫原制备、动物免疫、细胞融合及阳性杂交瘤细胞筛选和克隆获得，所述支原体为山羊支原体山羊肺炎亚种M1601，细胞融合时髓瘤细胞和脾细胞的数量比为1/5～1/10，得到的丝状支原体簇单克隆抗体杂交瘤细胞株为5E5，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为C201972。所述的丝状支原体簇单克隆抗体可用于区分丝状支原体簇和细菌/病毒类病原体。本发明专利技术的杂交瘤细胞株能够分泌稳定的丝状支原体簇单克隆抗体特异性好，能够有效区分丝状支原体簇和其他常见反刍动物支原体。

A Monoclonal Antibody Against Mycoplasma filamentosum Cluster and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种丝状支原体簇单克隆抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于支原体检测鉴定
，尤其涉及一种丝状支原体簇单克隆抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
丝状支原体簇是柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属下一群遗传上和血清学关系相近的支原体，其组成为：除Mccp以外，还包括牛传染性胸膜肺炎(Contagiousbovinepleuropneumonia,CBPP)的病原丝状支原体丝状亚种小菌落型(Mycopalsammycoidessubsp.mycoidesSmallColony，MmmSC)、Mmc(包含MmmLC)、山羊支原体山羊亚种(Mycoplasmacapricolumsubsp.Capricolum，Mcc)和李奇氏支原体(M.leachii，原为牛支原体7型)，主要引起呼吸道疾病、关节炎、无乳症以及流产等，分布广泛，影响全世界范围内的畜牧业。与小反刍兽疫病毒、巴氏杆菌、其他的反刍动物支原体(主要为绵羊肺炎支原体(Movi)、牛支原体(Mb))等病原体引起的临床症状相似，不易区分，所以只能通过实验室诊断来进行疾病确诊。目前使用的区分方法主要包括病原分离培养、PCR以及血清学诊断方法，这些方法虽然可将其它细菌/病毒类病原体与丝状支原体区分开来，但由于丝状支原体分离培养的营养要求较高、pcr存在假阳性结果以及血清学诊断方法的交叉反应性使得丝状支原体簇与其它反刍动物支原体的区分仍旧困难。
技术实现思路
针对上述
技术介绍
中指出的不足，本专利技术提供了一种丝状支原体簇单克隆抗体及其制备方法和应用，本专利技术制备的单克隆抗体特异性好，能够有效区分丝状支原体簇和其他常见反刍动物支原体。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种丝状支原体簇单克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)支原体培养和免疫原制备所述支原体为：山羊支原体山羊肺炎亚种M1601，支原体进行培养、灭活、集菌及蛋白定量后冻存；(2)建立间接ELISA测定血清效价通过棋盘法确定间接ELISA的最佳抗原抗体工作浓度，4℃过夜包被，3％BSA封闭2h，一抗二抗分别于37℃孵育1h，用0.5％PBST洗板4次，每次3min；(3)动物免疫用步骤(1)制备的免疫原乳化后皮下注射6-8周龄的SPF级雌性BLAB/c小鼠，基础免疫3次，间隔2周，每只50μg/次，末次免疫7天后，尾部取血用酶联免疫试验测定血清效价，效价高于10-4的小鼠准备融合；(4)细胞融合骨髓瘤细胞和脾细胞的数量比为1/5～1/10，培养得到融合细胞；(5)阳性杂交瘤细胞筛选和克隆用步骤(2)建立的间接ELISA检测步骤(4)融合细胞的培养上清，筛选获得阳性克隆，将筛选出来的阳性细胞孔通过有限稀释法进行亚克隆，得到丝状支原体簇单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述丝状支原体簇单克隆抗体杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：C201972，分类命名为：杂交瘤细胞株5E5，保藏日期为：2019年5月8日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。本专利技术进一步提供了由上述丝状支原体簇单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的丝状支原体簇单克隆抗体。本专利技术进一步还提供了丝状支原体簇单克隆抗体在区分丝状支原体簇和细菌/病毒类病原体中的应用。相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术制备的丝状支原体簇单克隆抗体特异性好，能够有效区分丝状支原体簇和其他常见反刍动物支原体，在有关丝状支原体簇Westernblotting实验中，单抗可作为一抗阳性对照。附图说明图1是本专利技术实施例提供的WesternBlotting方法测定制备的单克隆抗体特异性的结果图。图2是本专利技术实施例提供的WesternBlotting方法测定健康小鼠血清作为阴性对照的结果图。图中：1-marker；2-Mccp181菌体蛋白；3-Mccp181膜蛋白；4-Mccp1601；5-Mccckid；6-MIPG50；7-MoviY98；8-MmmYG；9-MmcPG3；10-Mb08M。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。一种丝状支原体簇单克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：1.支原体培养和免疫原制备支原体为：山羊支原体山羊肺炎亚种M1601，该支原体在培养基中培养至颜色由红色转向黄色，取少量进行颜色变化单位CCU定量，用终浓度为0.2％的甲醛37℃条件下灭活12h，期间轻摇几次，10000r/min离心30min后集菌，用灭菌PBS重悬菌体再集菌，重复洗菌三次后进行蛋白定量，-20℃冻存。2.建立间接ELISA测定血清效价通过棋盘法确定间接ELISA的最佳抗原抗体工作浓度。4℃过夜包被，3％BSA封闭2h，一抗二抗分别于37℃孵育1h，用0.5％PBST洗板4次，每次3min。3.单克隆抗体制备(1)动物免疫用制备的免疫原乳化后皮下注射6-8周龄的SPF级雌性BLAB/c小鼠，基础免疫3次，间隔2周，每只50μg/次，初次免疫与等体积弗氏完全佐剂充分乳化，后2次免疫与弗氏不完全佐剂进行乳化，末次免疫7天后，尾部取血用酶联免疫试验测定血清效价，效价高于10-4的小鼠准备融合；(2)细胞准备a.骨髓瘤细胞制备i.通常在融合前两周复苏骨髓瘤细胞，应选用与免疫小鼠同品系的骨髓瘤细胞；ii.将冻存的骨髓瘤细胞从液氮罐中取出，迅速没入38℃的温水中至完全融化；iii.无菌操作将融化的细胞与5mlRPMI-1640培养液混合均匀，1000r/min离心15min，弃掉上清；iv.立即加入20％胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬细胞，转移到细胞瓶，在二氧化碳培养箱中培养，观察细胞的状态，每2天传代一次；观察细胞的状态，培养至对数生长期，换液约12h后，准备融合；v.融合前，收集细胞，转到离心管中，1000r/min离心10min弃掉上清，用不完全的RPMI-1640培养液重悬，取10μl悬液加10μl胎盼蓝染色，在细胞自动计数仪中计数。b.饲养细胞制备i.用于制备词养细胞的小鼠要选用与免疫小鼠相同品系的小鼠，本实验选用未免疫的BLAB/c小鼠，利用词养细胞中的腹腔巨噬细胞，不仅能提供细胞融合中所需细胞因子，还能吞喷细胞碎片。ii.融合前，将空白对照的小鼠拉颈处死，放入75％酒精中浸泡3-5min；转移到无菌操作台中，用无菌剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜；用注射器注入10ml细胞培养液，用镊子轻轻揉腹部，使培养液体与腹腔充分接触后尽量将液体吸净，可再吸取10ml培养液再重复一遍；iii.将吸出液与50mlHAT培养液充分混匀，吸取10μl细胞混悬液加胎盼蓝染色，在细胞自动计数仪中计数，用培养液适当稀释；平铺到96孔细胞培养板中，100μl/孔，盖上盖子，胶带封口，在细胞培养箱中培养，备用。c.免疫脾细胞制备i.融合前约2-3天加强免疫一次，选取抗体检测效价最高的小鼠取脾融合，将小鼠眼球采血，然后处死，在75％酒精中浸泡约5min；转移无菌操作台中，用小剪刀剪开小鼠脾脏的皮肤，用慑子拉开皮肤，暴露腹膜，换一副剪刀和镊子，剪开脾脏远端的腹膜，将腹膜提起，剪开近端的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种丝状支原体簇单克隆抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)支原体培养和免疫原制备所述支原体为：山羊支原体山羊肺炎亚种M1601，支原体进行培养、灭活、集菌及蛋白定量后冻存；(2)动物免疫用步骤(1)制备的免疫原乳化后皮下注射6‑8周龄的SPF级雌性BLAB/c小鼠，基础免疫3次，间隔2周，每只50μg/次，末次免疫7天后，尾部取血用酶联免疫试验测定血清效价，效价高于10

【技术特征摘要】
1.一种丝状支原体簇单克隆抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)支原体培养和免疫原制备所述支原体为：山羊支原体山羊肺炎亚种M1601，支原体进行培养、灭活、集菌及蛋白定量后冻存；(2)动物免疫用步骤(1)制备的免疫原乳化后皮下注射6-8周龄的SPF级雌性BLAB/c小鼠，基础免疫3次，间隔2周，每只50μg/次，末次免疫7天后，尾部取血用酶联免疫试验测定血清效价，效价高于10-4的小鼠准备融合；(3)细胞融合骨髓瘤细胞和脾细胞的数量比为1/5～1/10，培养得到融合细胞；(4)阳性杂交瘤细胞筛选和克隆用间接ELISA检测步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：储岳峰，吴娅琴，颜新敏，郝华芳，陈胜利，刘永生，赵天荣，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62