免疫球蛋白亚型抗体的制备方法技术

本发明专利技术提供了免疫球蛋白亚型抗体的制备方法，包括：制备IgG粗制品，透析除盐，层析纯化，浓缩IgG，病毒灭活和保存六个步骤；其中，采用中性饱和硫酸铵溶液对血清进行多次离心提纯制备得到IgG粗制品，并采用了DEAE纤维素、QAE纤维素、Sephadex G150或Sephadex G200柱进行层析纯化。本发明专利技术采用盐析法和离子交换层析法结合提取的免疫球蛋白亚型的纯度得到了大大提高，纯度提高在5倍以上，而且可以除去DNA和RNA等；具有纯度高、成本低、设备简单、对被分离物可保存其生物活性的特点。

Preparation of Immunoglobulin Subtype Antibody

【技术实现步骤摘要】
免疫球蛋白亚型抗体的制备方法
本专利技术涉及免疫球蛋白G的
，具体地，涉及免疫球蛋白亚型抗体的制备方法。
技术介绍
B淋巴细胞在抗原刺激下转化为浆细胞，产生能与相应抗原发生特异性结合的抗体，称为免疫球蛋白。免疫球蛋白G（IgG）是血清中免疫球蛋白的主成分，约占血清中免疫球蛋白总含量的75%。IgG有4个亚型，即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，这四种亚型在正常人体所占含量比率分别为60-70%、14-20%、4-8%及2-6%。IgG是体内最主要的抗体，具有抗病毒、中和病毒、抗菌及免疫调节的功能，IgG1、IgG3主要对抗蛋白质抗原，如常见的病毒感染等。IgG2为对抗含多醣体荚膜细菌的主要抗体，发育最慢，最易缺乏。而IgG4与食物之过敏反应有关。IgG2、IgG3、IgG4亚型的量会被主要的IgG1遮盖，故不论IgG总量为低值或正常值，皆不能排除出现亚型缺陷的情况，其缺乏可以单独出现或组合出现。IgG也是唯一能够通过胎盘的抗体，在新生儿抗感染中起重要作用。有些自身抗体，如系统性红斑狼疮的LE因子，抗甲状腺球蛋白抗体也属于IgG。检测血清中的IgG含量，最常用的方法是单向免疫扩散法和免疫比浊法，但后者已逐渐代替前者。免疫球蛋白IgG是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75%，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。粗提法提取免疫球蛋白IgG大多用硫酸铵盐析法或硫酸钠盐析法，盐析法具有成本低，设备简单，对被分离物可保存其生物活性的特点；但其提取的产品纯度不高。离子交换层析法提取IgG常用的离子交换剂有DEAE纤维素，经离子交换层析法得的IgG较纯，不含其他杂蛋白。有机溶剂法具有快速，简单易行，抗体效价高，特异性好的优点，而且最重要的是抗体亲和力较强；但其只适合于提纯IgG1和IgG2b，对IgG3的回收率及纯化效果差。聚乙二醇法反应条件温和，特异性强，得率高，药品的用量少，不必进行脱盐处理，所得IgG活性的保持时间比较长，适应于不稳定的生物大分子的分离；但此法去除聚乙二醇操作较为复杂。亲和膜色谱法是一种较有效的生物活性物质纯化方法，蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，活性回收率提高；纯化步骤简单，适用于不稳定蛋白的纯化；但其会吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体会脱落进入分离体系，载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，配基与载体耦联条件激烈等。盐析法是1878年Hammarsten首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白和球蛋白两部分。随着技术的发展曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在0-30℃范围内溶解度变化不大；而且硫酸铵价廉易得，分段效果比其他盐好，性质温和，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的生物活性。现在所指的盐析法实际上多为硫酸铵盐析法。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供一种免疫球蛋白亚型抗体的制备方法，本专利技术采用盐析法和离子交换层析法结合提取的免疫球蛋白亚型的纯度得到了大大提高，纯度提高在5倍以上，而且可以除去DNA和RNA等；具有纯度高、成本低、设备简单、对被分离物可保存其生物活性的特点。根据本专利技术的一个方面，提供一种免疫球蛋白亚型抗体的制备方法，包括以下步骤：步骤一，制备IgG粗制品：取血清与等量的生理盐水混合，逐滴加入中性饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，使其饱和度为45-50%，充分混合后，室温放置30-60min后，3000r/min离心20min，离心取沉淀；沉淀用生理盐水溶解后，逐滴加入中性饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，使其饱和度为30-33%，充分混合后，室温放置30-60min后，离心取沉淀；沉淀用生理盐水溶解后，即为IgG粗制品；步骤二，透析除盐：将步骤一中的IgG粗制品于0.01mol/LpH6.8-7.4的磷酸盐缓冲液的大烧杯中透析约24h，换液3-4次，至透析液中无硫酸根离子；步骤三，层析纯化：将步骤二作用后的IgG制品过DEAE纤维素柱层析纯化；步骤四，浓缩IgG：将层析纯化后的IgG制品浓缩至1%以上的浓度；步骤五，病毒灭活，将IgG制品经低pH孵放处理灭活病毒后，采用纳米膜过滤进一步去除病毒；步骤六，保存：分装成小瓶冻干保存，或加0.01％庆大霉素在普通冰箱或低温冰箱保存。盐析所得的蛋白质中含有大量硫酸铵，将影响离子交换层析，因此在层析纯化前需要“脱盐提纯”。优选的，所述中性饱和硫酸铵溶液的制备方法为：将800-850g硫酸铵和1000mlH2O在不断搅拌下加热至55-60℃，并保持6-10min后，趁热过滤，滤液置室温过夜，再以28％NH4OH调pH至7.0，形成中性饱和硫酸铵溶液。市售固体硫酸铵中一般残留有硫酸，其制备的饱和硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，所以需要调成中性饱和溶液再与血清作用。优选的，所述硫酸铵溶液在滴加使用前用EDTA螯合剂或H2S除去其内的金属离子。在硫酸铵中一般含有一些重金属离子，用量过大易使蛋白质变性，需将其内含有的金属离子除去。硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。若次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可，或用EDTA螯合剂作用以螯合其内的金属离子。优选的，所述步骤一中操作：沉淀用生理盐水溶解后，逐滴加入中性饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，使其饱和度为30-33%，充分混合后，室温放置30-60min后，离心取沉淀；重复该操作2-3次，以完全除去白蛋白。优选的，所述步骤二中也可采用SephadexG25或电透析除盐。优选的，所述步骤二中透析除盐采用透析袋或玻璃纸进行。优选的，所述步骤二中透析除盐后用1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4，直至无SO42-或NH4出现为止。纳氏试剂检查NH4时取3-4ml透析液，加试剂1-2滴，出现砖红色即认为有NH4存在。优选的，所述步骤三中也可采用QAE纤维素、SephadexG150或SephadexG200柱层析纯化。SephadexG为交联葡聚糖，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围；G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍，例如G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克。优选的，所述IgG制备的纯度采用区带电泳法、琼脂双相双扩散鉴定法、免疫电泳鉴定法或圆盘电泳鉴定法鉴定。优选的，该制备方法可以用来制备免疫球蛋白亚型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：（1）本专利技术涉及的免疫球蛋白亚型抗体的制备方法，采用盐析法和离子交换层析法结合提取的免疫球蛋白亚型的纯度得到了大大提高，纯度提高在5倍以上，而且可以除去DNA和RNA等；（2）本专利技术涉及的免疫球蛋白亚型抗体的制备方法，制备工艺简单，生产稳定安全，提纯效果显著；（3）本专利技术涉及的免疫球蛋白亚型抗体的制备方法，病毒灭活采用低pH孵放灭活和纳米过滤去除，双重病毒灭活方法提升了病毒的灭活率，保证了产品的安全性；（4）本专利技术涉及的免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.免疫球蛋白亚型抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，制备IgG粗制品：取血清与等量的生理盐水混合，逐滴加入中性饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，使其饱和度为45‑50%，充分混合后，室温放置30‑60min后，3000r/min离心20min，离心取沉淀；沉淀用生理盐水溶解后，逐滴加入中性饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，使其饱和度为30‑33%，充分混合后，室温放置30‑60min后，离心取沉淀；沉淀用生理盐水溶解后，即为IgG粗制品；步骤二，透析除盐：将步骤一中的IgG粗制品于0.01mol/L pH 6.8‑7.4的磷酸盐缓冲液的大烧杯中透析约24h，换液3‑4次，至透析液中无硫酸根离子；步骤三，层析纯化：将步骤二作用后的IgG制品过DEAE纤维素柱层析纯化；步骤四，浓缩IgG ：将层析纯化后的IgG制品浓缩至1%以上的浓度；步骤五，病毒灭活，将IgG制品经低pH 孵放处理灭活病毒后，采用纳米膜过滤进一步去除病毒；步骤六，保存：分装成小瓶冻干保存，或加0.01％庆大霉素在普通冰箱或低温冰箱保存。

【技术特征摘要】
1.免疫球蛋白亚型抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，制备IgG粗制品：取血清与等量的生理盐水混合，逐滴加入中性饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，使其饱和度为45-50%，充分混合后，室温放置30-60min后，3000r/min离心20min，离心取沉淀；沉淀用生理盐水溶解后，逐滴加入中性饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，使其饱和度为30-33%，充分混合后，室温放置30-60min后，离心取沉淀；沉淀用生理盐水溶解后，即为IgG粗制品；步骤二，透析除盐：将步骤一中的IgG粗制品于0.01mol/LpH6.8-7.4的磷酸盐缓冲液的大烧杯中透析约24h，换液3-4次，至透析液中无硫酸根离子；步骤三，层析纯化：将步骤二作用后的IgG制品过DEAE纤维素柱层析纯化；步骤四，浓缩IgG：将层析纯化后的IgG制品浓缩至1%以上的浓度；步骤五，病毒灭活，将IgG制品经低pH孵放处理灭活病毒后，采用纳米膜过滤进一步去除病毒；步骤六，保存：分装成小瓶冻干保存，或加0.01％庆大霉素在普通冰箱或低温冰箱保存。2.根据权利要求1所述的免疫球蛋白亚型抗体的制备方法，其特征在于，所述中性饱和硫酸铵溶液的制备方法为：将800-850g硫酸铵和1000mlH2O在不断搅拌下加热至55-60℃，并保持6-10min后，趁热过滤，滤液置室温过夜，再以28％NH4OH调pH至7.0，形成中性饱和硫酸铵溶液。3.根据权利要求1所述的免疫球蛋白亚型抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵海峰，蒙凯，李俊英，李家维，
申请(专利权)人：贵州盛世康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：贵州,52