特异结合DDX24解旋酶的多肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一系列特异性识别并结合DDX24解旋酶的多肽及其应用，所述多肽的序列包括了以下氨基酸特征序列：1.氮端‑SQETFSDLWKLLPEN‑羧基端；2.氮端‑S(p)QET(p)FSDLWKLLPEN‑羧基端；3.氮端‑LTFEHYWAQLTS‑羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸，（p)代表S或者T的羟基被磷酸化修饰。目前并无特异性识别DDX24的多肽，本发明专利技术的多肽衍生于p53蛋白转录功能域，首次证明这些多肽可以特异结合并识别DDX24解旋酶。

Polypeptide Specifically Binding to DDX24 Helicase and Its Application

【技术实现步骤摘要】
特异结合DDX24解旋酶的多肽及其应用
本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一系列特异性结合DDX24解旋酶的多肽及其应用。
技术介绍
DDX24是一种ATP依赖的RNA解旋酶，由DDX24基因所编辑，它属于DDX蛋白家族。该家族的蛋白涉及RNA二级结构改变的细胞过程，如蛋白翻译启动，线粒体RNA的剪切，以及核糖体和剪接体的组装过程(StaleyandGuthrie1998,Cell92:315-325;Berthelot,Muldoonetal，2004MolecularMicrobiology51(4):987-1001;Linder2006,Gene&Development19:2122-2137)。DDX24在人类多种癌细胞中过表达。还有文章指出DDX24与多脏器静脉、淋巴管畸形的联系，提示DDX24在内皮细胞中的重要作用，参与血管畸形的形成(Pang,Huetal，2019,Hepatology69(2):803-816)。因此，找出特异性结合DDX24解旋酶的探针对于了解DDX24在疾病发生发展过程中的作用，进而应用于疾病的早期检测、分子成像、药物的靶向输送具有重要意义。目前研究表明，DDX24可能是抑癌基因p53的一种负调控分子(Shi,Daietal，2016,Oncogene35(4):528-536)。DDX24通过抑制p300介导的p53乙酰化，进而促进p53介导的转录靶点p21，上调凋亡调节剂(PUMA)的激活。,DDX24在人类乳腺癌细胞中过表达，如果以RNA干扰导致DDX24蛋白水平降低，会使细胞周期阻滞和衰老，而且这种作用呈p53依赖性(Shi,Daietal，2016,Oncogene35(4):528-536)。这些结果表明，DDX24和p53在病变细胞中可能有密切的相互作用，并且这种相互作用对疾病的发生发展有重要影响。根据以上的一些背景，我们设计了具有高度特异性结合DDX24解旋酶的系列多肽。本专利首次发现衍生于p53转录活性区域的多肽(Kussie,Gorinaetal.1996,Science274:948-953)可以在体外直接结合重组的DDX24蛋白。此外，我们首次发现磷酸化修饰的基于p53的多肽(Feng,Jenkinsetal.2009,Structure17(2):202-210)也可以可以用来特异性识别DDX24解旋酶。另外我们首次测试发现由噬菌体展示实验针对Mdm2/Mdmx-p53筛选出的多肽（Hu,Gilkesetal.2007,CancerRes67(18):8810-8817）可以用来特异性识别DDX24解旋酶。。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供一种具有高度特异性结合DDX24解旋酶的多肽及其应用，该多肽能特异性识别DDX24解旋酶。特异性识别DDX24解旋酶的多肽，所述多肽的氨基酸序列包括如下所示的特征序列部分：1.氮端-SQETFSDLWKLLPEN-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸；2.氮端-S(p)QET(p)FSDLWKLLPEN-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸，（p)代表S或者T的羟基被磷酸化修饰；3.氮端-LTFEHYWAQLTS-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸；4.氮端-SGQHSHGYDDCWHQP-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸，这一序列的多肽具有和上述1-3相同长度，在实验中做为阴性对照。进一步的，所述肿瘤细胞选自DDX24高表达的SMMC-7721肝癌细胞株。所述p53多肽衍生于p53蛋白转录活性区域，通过常规多肽化学合成或者特异化学修饰得到。所述p53多肽可以结合、封闭、拮抗DDX24解旋酶。所述p53多肽经过化学发光、荧光、核素等标记，应用于制备DDX24解旋酶相关的药物或检测试剂中。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的多肽能特异性识别DDX24解旋酶，对于了解DDX24在疾病发生发展过程中的作用，进而应用于疾病的早期检测、分子成像、药物的靶向输送具有重要意义。本专利技术还包括将上述p53多肽应用于设计、制备与DDX24相关疾病的药物或检测试剂中。附图说明图1：对上述荧光标记多肽序列以SPR表面等离子共振分析技术测定体外与DDX24的结合力。测试条件：pH：10mMAcetate5.5，流速：10μl/min，流速：30μl/min，多肽浓度：0.78125/1.5625/6.25/12.5/25/50μg/ml，结合时间：120s，解离时间：120s。结果显示：多肽1的Kd=7.15+3.6μM，多肽2的Kd=1.83+0.2μM，多肽3的Kd=0.069+0.03μM，而对比多肽4无可测量的结合活性。图2：2A图中1-3多肽及对照多肽4标绿色FITC荧光。在96黑色荧光孔板内接种SMCC-7721细胞（标记为DDX24H）97L细胞（标记为DDX24L）。用细胞培养液将实验多肽1-3与对照多肽4稀释至终浓度10μM，孵育及洗脱后荧光检测仪读取细胞内特异结合多肽的信号（EM：528，EX：485）。结果显示，1-3多肽与对照多肽4对比，活细胞内摄取1-3多肽的量明显多于对照多肽4。DDX24高表达的SMMC-7721细胞与DDX24低表达的97L细胞对比，DDX24高表达的SMMC-7721细胞内摄取的1-3多肽明显多于DDX24低表达的97L细胞。2B、2C图中对96孔板内细胞冰上孵育30min，再次读数荧光信号以观察和37℃孵育结合情况下的区别。读数后，细胞重新放回37℃孵育2个小时，再次读取荧光信号。结果显示，SMMC-7721细胞（DDX24H）的荧光强度变化较97L细胞（DDX24L）更为明显，表现在低温环境时荧光强度增高，而恢复37℃时荧光强度又降低。图3：在SMCC-7721细胞选择标上绿色荧光（FITC）多肽3，加入40μM（终浓度）所述多肽3的培养液中，于37ºC孵育4h，0.1%BSA/PBS洗板三次，每次5分钟，后分别在37ºC或者4ºC固定（4%多聚甲醛）30分钟。然后洗板，室温封闭（3%BSA、PBS）30分钟，孵育DDX24抗体（ThermoFisher,PA5-51721），及红色荧光二抗（ThermoFisher,A21428），室温避光孵育1小时，并DAPI染核。最后荧光显微镜下观察并采集图像。结果显示：多肽3与细胞内DDX24结合后显示的相转移现象（黄色箭头表示的核内或者胞内颗粒状聚集在4ºC更加明显）与用DDX24特异性抗体染色结果完全一致。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详细予以说明。本专利技术实施例为：一种可以特异性结合DDX24解旋酶的p53多肽及其应用，所述p53多肽的序列包括：1.氮端-SQETFSDLWKLLPEN-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸；2.氮端-S(p)QET(p)FSDLWKLLPEN-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸，（p)代表S或者T的羟基被磷酸化修饰；3.氮端-LTFEHYWAQLTS-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸；4.氮端-SGQHSHGYDDCWHQP-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸，这一序列的多肽具有和上述1-3相同长本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性识别并结合DDX24解旋酶的多肽，其特征在于：所述多肽的序列中包括特征序列部分。

【技术特征摘要】
1.一种特异性识别并结合DDX24解旋酶的多肽，其特征在于：所述多肽的序列中包括特征序列部分。2.根据权利要求1所述的特异性识别并结合DDX24解旋酶的多肽，其特征在于：所述特征序列部分包括，氮端-SQETFSDLWKLLPEN-羧基端，氮端-S(p)QET(p)FSDLWKLLPEN-羧基端，氮端-LTFEHYWAQLTS-羧基端，其中英文字母代表常规天然氨基酸，（p)代表S或者T的羟基被磷酸化修饰。3.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：单鸿，金红军，高洁冰，杨帅，陈守登，陈秋樾，
申请(专利权)人：中山大学附属第五医院，
类型：发明
国别省市：广东,44