一种红藻藻红蛋白的制备方法技术

本发明专利技术提供一种操作简便，成本低廉且适合工业化生产，从红藻中提取PE的方法，本发明专利技术选用β‑琼胶酶和纤维素酶提取海洋红藻中藻红蛋白的方法，与传统技术相比节省了时间，降低了成本，大大简化操作，回收率高，纯度高，为藻红蛋白的工业化生产提供一种简便的方法。

A preparation method of phycoerythrin from red algae

【技术实现步骤摘要】
一种红藻藻红蛋白的制备方法
本专利技术属于一种生物
，涉及一种采用琼胶酶提取红藻中藻红蛋白的方法。
技术介绍
红藻指红藻门的藻类植物。红藻中，有一些营养丰富、味道鲜美的食用种类如紫菜、麒麟菜、海萝等；还有一些重要的经济种类，用来提取琼胶和卡拉胶，如石花菜、江蓠、皱波角叉菜、麒麟菜等植物，多数是多细胞的，少数是单细胞的，该门只有红藻纲，约有760属，4410余种。红藻纲又分两个亚纲：紫菜亚纲和真红藻纲；红藻因其富含生物活性物质（蛋白质、多不饱和脂肪酸及多糖）且具有良好的生物活性（抗氧化、抗炎、抗菌及抗肿瘤）而闻名，目前我国对红藻开发利用的力度和深度还很小，大部分仅限于简单的食用。藻红蛋白（PE）是红藻中重要的捕光色素蛋白，分子量在240kDa左右，在490～570nm可见光区具有较强的光吸收，α和β亚基是PE的基本构件，一个α亚基与一个β亚基构成一个单体，PE一般是含有3个或6个这种单体的三聚体或六聚体，主要存在形式为(αβ)6γ，聚集态越高，PE的捕光能力和光能传递能力越强。PE具有高度水溶性，常作为着色剂用于食品和化妆品行业，因其具有荧光特性，可作为荧光标记，示踪剂，免疫荧光探针等用于生物医药和免疫学研究。据报道PE具有多种生物活性，例如抗肿瘤，抗糖尿病，免疫增强和抗高血压，除此之外，还被开发成一种光敏剂，用于肿瘤光动力学治疗。PE是细胞内化合物，由于红藻细胞壁主要由多糖（琼脂，纤维素，木聚糖等）组成，限制了PE的释放。目前传统的提取方式有物理破碎法（超声破碎，液氮研磨，反复冻融），化学渗透法（细胞溶胀法，CaCl2溶液提取法），双水相萃取法，絮凝法等，由于这些方式成本高，耗时长，得率低等原因限制其工业化生产。酶解法是一种促使藻类细胞组织破坏释放化合物的有效替代方法，早在2008年Joubert和Fleurence使用木聚糖酶和纤维素酶进行研究，证实了酶回收PE的可行性，公开号CN101617784A也公布了一种使用纤维素酶和果胶酶提取紫菜中藻胆蛋白的方法，但目前没有应用琼胶酶辅助提取PE的报道出现。众所周知，红藻细胞壁含有大量的琼胶，这也是红藻作为琼胶提取来源的原因，琼胶酶可以将细胞壁中琼胶多糖降解成寡糖，从而更充分地释放PE。本专利技术通过加入β-琼胶酶和纤维素酶，硫酸铵盐析，超滤等技术提高了PE的得率和纯度，降低提取成本，减少提取时间，且经冷冻干燥后得到的藻红蛋白冻干粉可在低温下长期保存，适用于工业化生产，可促进产业升级。
技术实现思路
本专利技术提供一种操作简便，成本低廉且适合工业化生产，从红藻中提取PE的方法，具体内容是将红藻干燥后，用粉碎机彻底粉碎，过80目筛，红藻粉末与pH6.8～7.2的0.1M磷酸缓冲液按1:25～1:35比例充分混匀，得到悬液，或新鲜藻体与pH6.8～7.2的0.1M磷酸缓冲液按1:2～3匀浆,特定条件下加入质量浓度的0.001%～1%的β-琼胶酶和0.001%～1%纤维素酶，置于25～35℃下酶解4～6h，得到破壁液。将所得到的破壁液于8000r/min冷冻离心10min，得到上清液，向上清液加入饱和度为30%～60%的硫酸铵，在低温下静置过夜，再以8000r/min冷冻离心10min，取沉淀加入pH6.8～7.2的0.1M磷酸缓冲液复溶。复溶后的蛋白溶液进行超滤浓缩，所用超滤膜的截留分子量为50000Da。超滤脱盐效率比透析要高，在实现快速脱盐的同时也减少的液体体积，有利于后续的冷冻干燥，更适于工业化生产。专利技术的技术优势：本专利技术选用β-琼胶酶和纤维素酶提取海洋红藻中PE的方法，与传统技术相比节省了时间，降低了成本，大大简化操作，回收率高，纯度高，并且经过了实验室验证，为PE的工业化生产提供一种简便的方法。具体实施方式实施例1。（1）预处理：将干燥后的紫菜用粉碎机粉碎，过80目筛得到紫菜干粉末备用。（2）将步骤（1）中紫菜粉末与pH6.8～7.2的0.1M磷酸缓冲液按1:30比例充分混匀，得到混合液备用。（3）向步骤（2）中得到的细胞悬液中依次加入质量浓度0.02%的β-琼胶酶和0.02%纤维素酶，低速搅拌下30℃酶解5h，得到破壁液。（4）将步骤（3）所得到的紫菜破壁液于8000r/min冷冻离心10min，得到上清液。（5）向步骤（4）中的上清液加入饱和度为50%的硫酸铵，在低温下静置过夜，再以8000r/min冷冻离心10min，取沉淀加入pH6.8～7.2的0.1M磷酸缓冲液复溶。（6）将步骤（5）中复溶后的蛋白溶液进行超滤浓缩，所用超滤膜的截留分子量为50000Da。PE纯度（A560/A280）达到1.2，得率为0.83%（相对于紫菜干重）。（7）超滤结束后，将溶液冷冻干燥得到PE粉末。冻干的PE粉可在低温下长期保存，活性保持良好，有利于工业化生产和产品开发。实施例2。（1）预处理：将新鲜藻体用水清洗干净，沥水待用。（2）将步骤（1）新鲜藻体与pH6.8～7.2的0.1M磷酸缓冲液按1:2～3匀浆备用。（3）向步骤（2）中得到的细胞悬液中依次加入质量浓度0.01%的β-琼胶酶和0.01%纤维素酶，低速搅拌下30℃酶解5h，得到破壁液。（4）将步骤（3）所得到的紫菜破壁液于8000r/min低温离心10min，得到上清液。（5）向步骤（4）中的上清液经过减压浓缩至原体积的1/5，加入饱和度为50%的硫酸铵，在低温下静置过夜，再以8000r/min冷冻离心10min，取沉淀加入pH6.8～7.2的0.1M磷酸缓冲液复溶。（6）将步骤（5）中复溶后的蛋白溶液进行超滤浓缩，所用超滤膜的截留分子量为50000Da。PE纯度（A560/A280）达到1.2，得率为0.83%（相对于紫菜干重）。（7）超滤结束后，将溶液冷冻干燥得到藻红蛋白粉末。冻干的藻红蛋白粉可在低温下长期保存，该技术有利于工业化生产和保持产品活性。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.红藻干藻体或者鲜藻体经匀浆打碎后在缓冲液中加入β‑琼胶酶和纤维素酶降解得到破壁液；所得到的物质进行离心固液分离后加入硫酸铵，在低温下静置过夜，再以8000 r/min 冷冻离心10 min，沉淀加入pH 6.8～7.2的0.1M磷酸缓冲液复溶，复溶后的蛋白溶液进行超滤浓缩，所用超滤膜的截留分子量为50000 Da。

【技术特征摘要】
1.红藻干藻体或者鲜藻体经匀浆打碎后在缓冲液中加入β-琼胶酶和纤维素酶降解得到破壁液；所得到的物质进行离心固液分离后加入硫酸铵，在低温下静置过夜，再以8000r/min冷冻离心10min，沉淀加入pH6.8～7.2的0.1M磷酸缓冲液复溶，复...

【专利技术属性】
技术研发人员：江晓路，王纯，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37