一种检测克隆恩氏病血清抗体的多肽及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术检测领域，公开了一种检测克隆恩氏病血清抗体的多肽及其应用。包括结合克隆恩氏病血清抗体的特异性多肽，所述多肽为SEQ ID No.1‑16中的任意一种。本发明专利技术提供的的多肽序列对临床诊断为克隆恩氏病患者血清的结合显著高于对溃疡性结肠炎患者血清免疫球蛋白或健康人血清免疫球蛋白的结合。

A polypeptide for detection of serum antibodies to Crohn's disease and its application

【技术实现步骤摘要】
一种检测克隆恩氏病血清抗体的多肽及其应用
本专利技术涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种检测克隆恩氏病血清抗体的多肽及其在检测试剂盒方面的应用。
技术介绍
炎症性肠病（InflammatoryBowelDisease，IBD），是一种具有自身免疫病特征的慢性肠道炎症性疾病，包括克隆恩氏病（Crohn病）和溃疡性结肠炎。炎症性肠病的症状严重影响消化道功能，有疼痛，腹泻，便血等主要症状，肠道组织有炎症病灶，溃疡，严重时有肠道穿孔。炎症性肠病难治愈，有反复发作的特点，并有癌变的风险。炎症性肠病常见于西方国家，近年来在国内的发病率呈现上升趋势。克隆恩氏病是一种慢性的、反复发作的肠道性疾病，发病部位可以从口腔到肛门整个胃肠道的任何部分，晚期回肠和结肠是受影响最多的区域。这种疾病通常表现有腹痛、能量损失、体重减轻、盗汗、口腔溃疡和关节疼痛等。克隆恩氏病发病的机制与病因一直不明确，与遗传、免疫、肠道微生态等均有关联。对于克隆恩氏病的诊断目前主要依靠临床表现、实验室常规检测、放射性检查、内镜及病理学检查等手段，其中内镜及病理学检查是临床主要的诊断依据。由于非IBD炎性肠病与IBD的许多临床表现和病理变化相似，内镜及病理学检查常难以确诊，且内镜及病理学检查操作复杂，属于有创性，因此存在一定的局限性。而对非IBD炎性肠病与IBD的治疗方法不同，预后也不一样，所以需要更特异的方法加以鉴别。此外，对于IBD中的溃疡性结肠炎与克隆恩氏病，目前临床诊断方法也存在一定的鉴别困难。鉴于此，建立一种简单、无创、经济、快速、价廉的方法来进行克隆恩氏病的诊断具有重要的临床价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测克隆恩氏病血清抗体的多肽及其试剂盒，其中包括特异性结合克隆恩氏病血清抗体的多肽。本专利技术提供的的多肽对临床诊断为克隆恩氏病患者血清的结合显著高于对溃疡性结肠炎患者血清免疫球蛋白或健康人血清免疫球蛋白的结合，且本专利技术提供的试剂盒在检测克隆恩氏病血清抗体方面具有简单、无创、经济、快速、价廉、灵敏、特异性高的特点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种检测克隆恩氏病血清抗体的多肽，所述多肽包含SEQIDNo.1-16中所示的氨基酸序列中的一种或多种。优选的，所述多肽为SEQIDNo.2-16中所示的氨基酸序列中的一种或多种氨基酸序列.优选的，所述克隆恩氏病血清抗体包括免疫球蛋白A抗体和/或免疫球蛋白G抗体。一种检测克隆恩氏病血清抗体的试剂盒，包括所述多肽。优选的，所述试剂盒为酶联免疫试剂盒、免疫比浊法试剂盒、胶体金法试剂盒或免疫化学发光法试剂盒。优选的，所述酶联免疫试剂盒还包括酶标板、PBST洗涤缓冲液、样品稀释液、酶标二抗、PBST洗涤缓冲液、TMB显色液和硫酸终止液。本专利技术提供的多肽不仅能够与克隆恩氏病患者血清的抗体特异性结合，该多肽序列具有特殊而稳定的β－转角结构，并且该多肽位于三级结构的边缘位置，能够实现稳定结合，敏感性高。本专利技术提供的的多肽序列对临床诊断为克隆恩氏病患者血清的结合显著高于对溃疡性结肠炎患者血清免疫球蛋白或健康人血清免疫球蛋白的结合。并且本专利技术建立了检测克隆恩氏病患者血清抗体定量检测试剂与克隆恩氏病患者血清抗体检测试剂（酿酒酵母菌多糖抗原和大肠杆菌鞭毛蛋白CBir抗原）的联合检测方法，对于克隆恩氏病的诊断更具有临床意义。附图说明图1诺卡菌MCE蛋白与分枝杆菌MFS蛋白序列比对图。图2本专利技术的试剂盒检测克隆恩氏病血清抗体标准品的标准曲线。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的方案进行清楚完整的描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未知名生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1我们对分支杆菌转运蛋白（majorfacilitatorsuperfamily，MFS）和诺卡菌哺乳动物进入蛋白（Mammaliancellentryprotein，MCE）进行序列分析。根据图1所示的序列比对结果显示，诺卡菌MCE蛋白与分支杆菌MFS蛋白具有一段保守的序列，并通过人工合成的方法得到了这段保守区的氨基酸序列：IRGLFPN，该人工合成方法为常规的固相合成法。我们通过序列比对及结构预测结果得到的这个7肽符合β－转角这种特殊而稳定的结构表1.氨基酸极性分析结果对诺卡菌MCE蛋白与分枝杆菌MFS蛋白的保守序列7肽进行极性分析。表1a诺卡菌MCE蛋白MIRGLFPNMIRGLFPN蛋氨酸异亮氨酸精氨酸甘氨酸亮氨酸苯丙氨酸脯氨酸天冬酰胺极性、中性非极性、疏水碱性非极性、疏水非极性、疏水非极性、疏水非极性、疏水极性、中性表1b分枝杆菌MFS蛋白LIRGLFPNLIRGLFPN亮氨酸异亮氨酸精氨酸甘氨酸亮氨酸苯丙氨酸脯氨酸天冬酰胺非极性、疏水非极性、疏水碱性非极性、疏水非极性、疏水非极性、疏水非极性、疏水极性、中性根据诺卡菌MCE蛋白和分枝杆菌MFS蛋白三级结构预测结果显示，7肽的位置位于边缘无规则卷曲部位。将MCE蛋白与MFS蛋白靠近7肽附近的50个氨基酸进行二级结构预测，结果发现在7肽附近都有抗体结合位点。根据上述研究结果，专利技术人以具有克隆恩氏病血清抗体特异结合的多肽作为固定相，构建了能够选择性检测克隆恩氏病患者血清抗体的试剂盒，实现了对克隆恩氏病患者血清中抗体定性及定量的检测。实施例2制备酶联免疫试剂盒（1）试剂的准备：标准品：6个不同浓度的标准品溶液，标准品A为100U/mL、标准品B为50U/mL、标准品C为25U/mL、标准品D为12.5U/mL、标准品E为6.25U/mL、标准品F为0U/mL。对照品：需配置浓度为50-60U/ml的阳性对照品和浓度为5-10U/ml的阴性对照品。样品稀释液：按照一定比例将0.2M的PB缓冲液（PH=6.0±0.2）、NaCl、NH4Cl、酪蛋白、20%Tween-20、Triton-X100、灭活胎牛血清充分溶于水。1*PBST洗涤缓冲液:pH值为7.4，其中包括80mmol/L的Na2HPO4、20mmol/L的KH2PO4、100mmol/L的KCl、1400mmol/L的NaCl、体积分数为0.05%的Tween-20。TMB显色液：底物显色A液：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30%双氧水0.3ml，蒸馏水加至500ml；底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，取0.15gTMB溶于30mlDMSO中，蒸馏水加至500ml，使用时，取底物显色A液与底物显色B液等体积混合，即得TMB显色液。硫酸终止液：配置浓度为2M的稀硫酸溶液。酶标二抗：用辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG和/或IgA抗体。封板膜：为耐思PCR封板膜。（2）包被多肽酶标板：配制含有多肽的包被液，在96孔酶标板的每孔内加100µL，置4℃，16～18h。弃去包被液，每孔加入300µL1×清洗液，静置2min后甩掉孔内溶液并拍干；每孔加入200µL封闭液，25℃恒温培养箱内静置1.5h；弃去封闭液后，每孔加入300µL1×清洗液，静置2分钟后甩掉孔内液体并拍干；置25℃鼓风干燥箱内干燥5h。（3）分装：取1*PBST洗涤缓冲液、标准品、对照品、样品稀释液、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测克隆恩氏病血清抗体的多肽，其特征在于，所述多肽包含SEQ ID No.1‑16中所示的氨基酸序列中的一种或多种。

【技术特征摘要】
1.一种检测克隆恩氏病血清抗体的多肽，其特征在于，所述多肽包含SEQIDNo.1-16中所示的氨基酸序列中的一种或多种。2.如权利要求1所述的检测克隆恩氏病血清抗体的多肽，其特征在于，所述多肽为SEQIDNo.2-16中的氨基酸序列中的一种或多种。3.如权利要求1所述的检测克隆恩氏病血清抗体的多肽，其特征在于，所述克隆恩氏病血清抗体包括免疫球蛋白A抗体和/或免疫球蛋白G抗体。4.一种检测克隆恩氏病血...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈婷婷，杨武，牛林茹，王敏兰，奚瑞芳，阎婧，
申请(专利权)人：山西瑞豪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山西,14