L-天门冬酰胺酶XiDL及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了L‑天门冬酰胺酶XiDL及其编码基因和应用。本发明专利技术提供的蛋白质，来源于辛芳芳菌(Xinfangfangiasp.)，是一种L‑天门冬酰胺酶，命名为XiDL蛋白，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明专利技术还保护XiDL蛋白作为L‑天门冬酰胺酶的应用。本发明专利技术还保护XiDL蛋白在急性淋巴细胞白血病，淋巴系统恶性肿瘤和霍奇金淋巴瘤等治疗中的应用。本发明专利技术还保护一种用于防止油炸或烘焙食品中丙烯酰胺形成的制剂，其活性成分为XiDL蛋白。本发明专利技术对于相关医疗领域、食品工业领域等，具有重大的应用前景。

L-asparaginase XiDL and its coding genes and Applications

【技术实现步骤摘要】
L-天门冬酰胺酶XiDL及其编码基因和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及L-天门冬酰胺酶XiDL及其编码基因和应用。
技术介绍
L-天门冬酰胺酶(L-天冬酰胺酰胺水解酶，E.C3.5.1.1)催化L-天冬酰胺水解以产生L-天冬氨酸和氨，在医疗领域，微生物来源的L-天门冬酰胺酶用作抗肿瘤剂和抗白血病剂，例如治疗淋巴恶性肿瘤，急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤，同样也是治疗急性淋巴细胞白血病的主要药物之一，但它们的治疗利用受到涉及超敏反应和其它一些毒副作用的不良并发症的阻碍。而在食品领域，2002年4月瑞典国家食品管理局和斯德哥尔摩大学研究人员率先在炸薯条等油炸和烧烤类的淀粉食品中检出丙烯酰胺，研究表明，丙烯酰胺是一种神经毒素，于2017年被世界卫生组织国际癌症研究机构列为致癌物，人体可通过消化道、皮肤黏膜等多种途径接触丙烯酰胺。据报道，可以通过添加L-天门冬酰胺酶去除天冬酰胺(丙烯酰胺的重要前体)而不改变最终食品的外观和味道的优点，因此L-天门冬酰胺酶在食品领域具有重要的应用前景。但是目前，在食品工业中只有几种L-天门冬酰胺酶可以使用，如和两者都来自曲霉属(Aspergillussp.)，随着对L-天门冬酰胺酶的研究应用的不断深入，寻求具有不同活性和性质的新颖的L-天门冬酰胺酶，这有利于扩展其在医学领域、食品工业领域的用途。在医学领域，要求L-天门冬酰胺酶在生理pH和温度下具有高活性，在食品领域，则需要L-天门冬酰胺酶在较宽pH和温度范围内具有足够的活性，并且具有高酶活性，据目前的报道，符合上述要求的L-天门冬酰胺酶相对较少，本专利技术提供了新颖来源的L-天门冬酰胺酶XiDL及其编码基因和应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供L-天门冬酰胺酶XiDL及其编码基因和应用。本专利技术提供的蛋白质，来源于辛芳芳菌(Xinfangfangiasp.)，是一种L-天门冬酰胺酶，命名为XiDL蛋白，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)或(a7)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a3)含有(a1)的融合蛋白；(a4)在(a1)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；(a5)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白；(a6)将(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有L-天门冬酰胺酶功能的由其衍生的蛋白质。(a7)来源于辛芳芳菌，且与(a1)具有99％以上同源性，且具有L-天门冬酰胺酶功能的蛋白质。标签具体如表1所示。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDLHA9YPYDVPDYAXiDL蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。所述基因为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；2)编码区如序列表中序列4中第1-1173位核苷酸所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有L-天门冬酰胺酶功能蛋白的DNA分子；4)来源于辛芳芳菌，且与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有L-天门冬酰胺酶功能蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。含有所述基因的重组表达载体、表达盒或重组微生物均属于本专利技术的保护范围。本专利技术还保护XiDL蛋白作为L-天门冬酰胺酶的应用。应用XiDL蛋白作为L-天门冬酰胺酶时，采用的温度为25-80℃，采用的pH为3-11。应用XiDL蛋白作为L-天门冬酰胺酶时，采用的温度为60℃，采用的pH为6。本专利技术还保护XiDL蛋白在急性淋巴细胞白血病，淋巴系统恶性肿瘤和霍奇金淋巴瘤等治疗中的应用。应用XiDL蛋白治疗急性淋巴细胞白血病，淋巴系统恶性肿瘤和霍奇金淋巴瘤时，采用的温度为25-80℃，采用的pH为3-11。应用XiDL蛋白治疗急性淋巴细胞白血病，淋巴系统恶性肿瘤和霍奇金淋巴瘤时，采用的温度为60℃，采用的pH为6。本专利技术还保护L-天门冬酰胺酶用于抑制炸薯条中的丙烯酰胺中的应用。所述的应用将原料浸泡在浓度为8U/mL的L-天门冬酰胺酶溶液中，其物料比为1:2-1:3，浸泡温度40℃，时间30min。本专利技术提供的L-天门冬酰胺酶XiDL具有较高的酶活力，宽泛的底物，并且反应温度宽泛，反应pH宽泛，对于金属离子、还原剂、和表面活性剂均具有高耐受性。辛芳芳菌(Xinfangfangiasp.)DLY26已于2019年1月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCCNo：M2019001。本专利技术对于相关医疗领域、食品工业领域等，具有重大的应用前景。附图说明图1为菌株DLY26的照片。图2为系统发生树。图3为XiDL蛋白溶液的电泳图。图4为检测最适pH时的相对酶活结果。图5为检测最适反应温度时的相对酶活结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、辛芳芳菌DLY26的分离、鉴定和保藏一、分离取约1ml活性污泥样品(取自石化炼油化污水处理系统)，用无菌蒸馏水依次稀释至10倍体积、20倍体积、50倍体积、100倍体积和1000倍体积。采用涂布平板法将100μl稀释后样本涂布于固体培养基表面，30℃培养，每天观察表面菌落的生长情况。挑取颜色不同、形态差异的菌落，通过三区划线法进行纯化和培养，直至在培养基表面生长出能够观察到形态、大小等特征都相同的单菌落为止。二、鉴定将纯化获得的菌株接种于TSA平板，30℃培养24h，然后使用透射电子显微镜观察细胞的形态、大小等特征(菌株DLY26的照片见图1)。从培养24h的TSA平板表面挑取单菌落，按照标准方法进行革兰氏染色处理，使用倒置荧光显微镜观察细菌的革兰氏染色情况。制备半固体培养基TSB，采用穿刺接种法观察细菌的运动性和好氧性情况。以液体培养基TSB为基础：配制不同NaCl浓度的培养基体系(NaCl梯度为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0及9.0g/100mL)，接种后置于30℃的摇床中振荡培养3-5d，使用UV-2450分光光度计在OD600处检测细菌的其生长情况，以确定最佳盐度生长范围；配制pH值不同的液体培养基(pH梯度设置为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)，接种后置于30℃的摇床中振荡培养3-5d，以培养条件相同的不接菌培养基作为空白对照，以确定最佳生长pH范围；设置温度梯度为4℃、20℃、28℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃，以确定最佳生长温度范围。以液体碳源培养基为基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)或(a7)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a3)含有(a1)的融合蛋白；(a4)在(a1)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；(a5)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白；(a6)将(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有L‑天门冬酰胺酶功能的由其衍生的蛋白质。(a7)来源于辛芳芳菌，且与(a1)具有99％以上同源性，且具有L‑天门冬酰胺酶功能的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)或(a7)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a3)含有(a1)的融合蛋白；(a4)在(a1)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；(a5)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白；(a6)将(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有L-天门冬酰胺酶功能的由其衍生的蛋白质。(a7)来源于辛芳芳菌，且与(a1)具有99％以上同源性，且具有L-天门冬酰胺酶功能的蛋白质。2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；2)编码区如序列表中序列4中第1-1173位核苷酸所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建国，郗丽君，刘德健，窦珂，谭雯斐，贾庆珠，苏石晶，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：山东,37