吡虫啉抗体特异性结合的噬菌体展示多肽及其用途制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及具有与吡虫啉抗体特异性结合的多肽，以及该多肽在检测吡虫啉中的应用。本发明专利技术采用噬菌体展示技术，用蛋白A柱纯化的吡虫啉抗体对噬菌体展示随机线十二肽库进行3轮淘选，淘选出与吡虫啉抗体结合的噬菌体克隆；随机挑取若干噬菌体克隆进行扩增和质粒提取，通过噬菌体ELISA方法选择阳性噬菌体克隆，并将阳性克隆进行测序获得多肽序列。本发明专利技术还涉及该噬菌体展示多肽在吡虫啉检测中的应用。用该噬菌体展示多肽建立的噬菌体酶联免疫分析方法可用于快速、灵敏、简便和廉价检测环境和农产品中吡虫啉残留。

Phage Display Polypeptide Specifically Binding Imidacloprid Antibody and Its Application

【技术实现步骤摘要】
吡虫啉抗体特异性结合的噬菌体展示多肽及其用途
本专利技术属于生物
，涉及具有与吡虫啉抗体特异性结合的多肽，包括所述多肽在检测吡虫啉中的应用。
技术介绍
吡虫啉是一种烟碱类超高效杀虫剂，并具有触杀、胃毒和内吸等多重作用。由于吡虫啉的广泛、持续和大量的使用导致了许多害虫天敌的死亡，研究发现吡虫啉对稻飞虱的天敌黑肩绿盲蝽和蚜虫的天敌龟纹瓢虫有较大的毒性，且对水生生物、蜜蜂以及土壤中的有益生物均会造成损伤。为预防吡虫啉应用存在的潜在风险，需要一种灵敏、快速、选择性的残留检测方法。目前对吡虫啉的残留检测，主要采用仪器分析方法(如液相色谱、气相色谱-质谱联用仪等)检测吡虫啉在农产品和农业环境中的残留，仪器检测灵敏度高、准确性强，但相对用时较长、操作复杂，不能满足快速检测大量样品的需求。且全新的农药残留检测体系，对农药残留检测分析技术提出更高的标准和更严格的要求：不只推动着农药残留检测技术向着更加快速、简便、灵敏可靠的检测目标发展，而且逐步由原先的在实验室进行少量室内检测演变为如今的现场及时检测以及实验室的大批次、高通量检测。免疫检测技术具有简便、快速、低成本和可靠的特点，极大的推动了农药残留快速检测技术的发展，为保障农产品的质量安全和环境的生态安全提供重要的工具。由于农药等小分子化学品为单抗原决定簇分析物，整个分子只能和一个抗体结合，所以通常选择竞争模式来建立免疫分析方法。在这种形式中，必须存在与分析物竞争结合抗体的竞争物，这个竞争物通常是将半抗原与蛋白、酶或荧光物等连接制备获得。根据竞争物与免疫抗原结构的同异，可以将分析方法分为同源和异源免疫分析。目前，农药异源竞争物通常采用化学合成的方法制备，系列异源半抗原的化学合成及半抗原与蛋白、酶或荧光物的偶联需要很大的工作量，并且不能预知制备的竞争物是否具有活性，所以存在一定的盲目性。自噬菌体展示技术报道以来便引起了研究人员的广泛关注，并且成为迄今为止发展最成熟、应用最广泛的抗体筛选技术。该技术已经被广泛应用于各种功能性重组多肽及抗体的高通量筛选。其原理是将编码多肽或外源蛋白的DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面。被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性以利于靶标分子的识别和结合，并使基因型与表型建立直接的联系。导入多种外源基因的一群噬菌体，就构成了一个噬菌体展示库。当噬菌体库与靶标分子即抗体通过3到5轮的“吸附-洗涤-洗脱-扩增”淘选后，与抗体特异性结合的噬菌体就会得到高度的富集。由已经商品化的抗噬菌体的二抗识别，可直接用作竞争物建立异源竞争免疫分析。与化学合成的竞争物相比，具有简单、快捷、安全环保且灵敏度更高的优点。但目前为止，尚未见具有与吡虫啉抗体特异性结合的多肽及其应用的研究和报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供与吡虫啉抗体特异性结合的多肽，及相关多肽在吡虫啉检测中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现：(1)将蛋白A柱纯化的吡虫啉抗体包被在酶标板上，用5％脱脂奶粉封闭酶标板，随后将噬菌体展示随机线十二肽库加入酶标板中进行亲和淘选，淘选过程按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的步骤进行，经过3轮的富集淘选，从第一轮到第三轮包被抗体的用量和用于竞争洗脱噬菌体的吡虫啉用量依次减少；(2)3轮淘选后，挑选30个噬菌体克隆进行ELISA初步鉴定，对于得到的13个阳性克隆进行扩增、质粒提取、测序，共发现2种序列，其序列如SEQIDNO1～2所示：HisSerLeuTrpMetAlaSerProMetProGlyTyr和GlnIlePheThrSerSerProMetProAlaMetVal。本专利技术所述的多肽可与吡虫啉抗体特异性结合，建立异源竞争ELISA，用于吡虫啉在环境与农产品中的残留检测。本专利技术具有以下有益效果：(1)新颖：为国内外首次报道的与吡虫啉抗体特异性结合的多肽；(2)实用：利用本专利技术提供的噬菌体展示多肽可以快速建立高敏感性的异源竞争ELISA；(3)特异性强：用本专利技术提供的噬菌体展示多肽建立的竞争ELISA与吡虫啉类似物的交叉反应，除氯噻啉(102％)外，其余均很低；(4)准确度高：利用本专利技术提供的噬菌体展示多肽实现的竞争ELISA在环境和农业样品中的添加回收率为70.1-102.1％，变异系数低于10.2％，符合残留分析标准；(5)灵敏度高：利用本专利技术提供的噬菌体展示多肽实现的竞争ELISA的抑制中浓度(IC50)为0.067ng/mL，检测限(IC10，LOD)为0.024ng/mL。附图说明图1是挑选的30个噬菌体克隆噬菌体ELISA(P-ELISA)检测的结果；横坐标为噬菌体克隆，纵坐标为OD450值；图2是P-ELISA检测吡虫啉，OD值与吡虫啉浓度的曲线；横坐标为吡虫啉的浓度，单位为ng/mL；纵坐标为OD450值。具体实施方式本专利技术实施例中所用实验材料、主要试剂及配方如下：主要实验材料：蛋白A柱纯化吡虫啉单克隆抗体由南京农业大学，植物保护学院，农药残留与环境毒理实验室制备；噬菌体展示随机线十二肽库从NEB公司购买。主要试剂：蛋白胨(OXOID)、酵母提取物(OXOID)、琼脂(Amresco)、琼脂糖(Amresco)、四甲基联苯胺(Sigma)、IPTG(Amresco)、Xgal(Amresco)、PEG8000(Sigma)、辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体(GE)主要试剂配方：1、LB培养基：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCl，高压灭菌，室温贮存；2、LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mLIPTG/Xgal，混匀倒平板。平板4℃避光贮存；3、顶层琼脂：每升含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCl，7g琼脂粉。高压灭菌，固体培养基室温贮存，用时微波炉融化；4、四环素贮液：以20mg/mL的浓度溶于50％乙醇中，-20℃避光贮存，用前摇匀；5、LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mL四环素贮液，混匀倒平板，平板4℃避光贮存；6、封闭液：含有5％脱脂奶粉，0.14M，pH7.4PBS，过滤除菌，4℃保存；7、PEG/NaCl：20％(w/v)PEG-8000，2.5MNaCl，高压灭菌，室温贮存；8、IPTG/Xgal配方：将1.25gIPTG(isopropylβ-D-thiogalactoside)和1gXgal溶于25mL二甲基甲酰胺中，-20℃避光贮存；9、显色液(四甲基联苯胺-H2O2底物溶液)：25mL0.1M，pH5.5柠檬酸盐缓冲液中加入0.4mL，6mg/mL四甲基联苯胺，0.1mL1％H2O2。实施例1吡虫啉抗体特异性结合多肽的淘选和制备1、与吡虫啉抗体特异性结合的噬菌体克隆的淘选按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的循环进行，经过3轮的淘选，具体操作如下：(1)取100μL100μg/mL蛋白A柱纯化的吡虫啉抗体加入酶标板中，4℃包被过夜，共三个孔；(2)取少量大肠杆菌ER2738涂在LB+Tet平板上，37℃过夜培养；(3)将步骤(1)的酶标板用PBST洗涤3遍，每孔加入300μL5％脱脂奶粉，37℃孵育2小时，用PBST洗涤3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.具有与吡虫啉抗体特异性结合的多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.具有与吡虫啉抗体特异性结合的多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQIDNO：2的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述具有与吡虫啉抗体特异...

【专利技术属性】
技术研发人员：王鸣华，华修德，杜梅，丁园，陈贺，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32