一种能够显著清除活性氧（ROS）的天然寡肽制造技术

本发明专利技术提供一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽，属于辣木籽深加工领域领域，该天然寡肽分离自辣木籽蛋白水解物，氨基酸序列为Gln‑Tyr，分子量为309.18Da。该天然寡肽的制备方法为：用风味蛋白酶对辣木籽蛋白水解，然后进行分离纯化。本发明专利技术提供的天然寡肽通过提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性来清除细胞内ROS，该天然寡肽分子量低，容易穿过屏障，靠近缺电子基团，能够增强肽的活性，带有非极性脂肪团的疏水氨基酸Tyr，对疏水脂肪酸具有较高的反应活性，对该天然寡肽进一步处理后，其表面疏水性提高，容易捕获脂质，且Fe

A Natural Oligopeptide capable of Clearing Reactive Oxygen Species (ROS) Significantly

【技术实现步骤摘要】
一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽
本专利技术属于辣木籽深加工领域，具体涉及一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽。
技术介绍
活性氧(ROS)包括羟基自由基、超氧阴离子自由基、单线态氧和过氧化氢，是人类细胞正常代谢的副产物，在细胞信号转导和增殖中发挥重要作用。过量的ROS会导致氧化和抗氧化作用失衡，超过细胞在体内的有效抗氧化反应能力时，会在体内引发氧化应激反应。氧化应激可引起蛋白质交联、脂质过氧化、DNA和RNA损伤等氧化损伤，进而导致糖尿病、心血管疾病、类风湿关节炎、癌症、帕金森病等一系列疾病。为了减少或抑制自由基的产生，常见的人工抗氧化剂叔丁基对苯二酚、二叔丁基对甲酚和丁茴香醚已经广泛应用于食品保鲜，但其肝损伤和致癌性的缺陷对人类健康造成潜在的巨大的威胁，从而限制了他们的使用范围和用量。因此，寻找天然、高效、无毒的抗氧化剂作为合成抗氧化剂的替代品，一直是人们的主要兴趣。近年来，抗氧化肽因其来源广泛、抗氧化活性强而受到广泛关注。辣木属辣木科多年生木本植物，原产于热带或南亚热带干旱或半干旱地区。一系列研究发现，辣木叶、种子和根的提取物对人类有很多好处，如抗糖尿病和保护肝脏，抗尿石性能，以及改善肝纤维化。我们之前的研究表明，FM3(辣木籽蛋白水解物的分子量小于3.5kDa)能有效地清除DPPH·(EC504.0mg/mL)，HO·(EC504.2mg/mL)，O2-·(EC504.3mg/mL)和ABTS·+(EC505.3mg/mL)。现有技术如授权公告号为CN20130404993.4B的中国专利技术专利，公开了一种核桃粕抗氧化肽及其制备方法，该专利技术利用核桃粕蛋白，通过酶法水解，得到青养蛋白酶解液，再利用凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱对其进行分离纯化得到十四种新的抗氧化肽产品，并测定其氨基酸序列。本专利技术所制得的抗氧化肽具有很强的抗氧化作用，氧自由基吸收能力都约为粗肽的4倍，而且肽具有分子量小、可被人体直接吸收的特点，因此可以广泛应用于食品、保健品及化妆品等领域。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽，该天然寡肽分子量低，容易穿过屏障，靠近缺电子基团，增强肽的活性，带有非极性脂肪团的疏水氨基酸Tyr，对疏水脂肪酸具有较高的反应活性，表面疏水性较高，容易捕获脂质，对Fe2+的静电吸引作用较强。本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽，是清除细胞内ROS的天然寡肽，分离自辣木籽蛋白水解物，该天然寡肽的氨基酸序列为Gln-Tyr，分子量为309.18Da。肽的抗氧化活性与其氨基酸的组成及排列顺序、疏水性、空间体积大小及酸碱性等有关。辣木籽蛋白含有较丰富的具有供质子或供电子能力的氨基酸，包括Tyr、Met、Cys，较丰富的疏水性氨基酸包括Leu、Pro、Phe、Val以及丰富的酸性氨基酸Glu。因此，对辣木籽蛋白进行水解可以制备得到具有强抗氧化活性的辣木籽肽。一般来说，低分子量、疏水性和芳香氨基酸的多肽具有较高的抗氧化活性。含2-10个氨基酸的短肽具有较强的自由基清除活性，能有效抑制脂质过氧化，可以穿过膜屏蔽并在组织水平上发挥多种生物活性，分子质量越小越容易穿过屏障，靠近缺电子基团，增强肽的活性；较大分子质量的多肽与自由基反应时存在空间位阻，导致多肽的抗氧化活性下降。含有非极性脂肪族基团Tyr的疏水氨基酸对疏水脂肪酸具有较高的反应活性，能够有效清除高脂食物的自由基。多肽序列中芳香氨基酸残基Tyr的芳香环可以促进促氧化金属离子的螯合，因此带有非极性脂肪团的疏水氨基酸Tyr对该寡肽的抗氧化活性贡献较大。作为优选，上述天然寡肽能够提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性。在生物体中，有酶和非酶的抗氧化系统来保护自己免受活性氧损伤。超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)是人体天然的抗氧化酶，可将氧自由基最终转化为水进入人体，本专利技术提供的天然寡肽通过提高抗氧化酶的活性来提高清除细胞内ROS的能力。作为优选，上述天然寡肽对DPPH自由基的半数有效浓度为0.75mg/mL，对ABTS自由基的半数有效浓度为0.33mg/mL。本专利技术提供的寡肽对DPPH自由基的半数有效浓度明显低于分离前辣木籽蛋白水解物的半数有效浓度，并且显著低于来源于欧洲泥鳅、大鲑鱼胸鳍、鳐科软骨以及蓝贻贝的抗氧化肽的半数有效浓度，因此，能够有效的清除DPPH自由基。本专利技术提供的寡肽对ABTS自由基的半数有效浓度明显低于分离前辣木籽蛋白水解物的半数有效浓度，并且显著低于来源于玉米麸粉、绿鳍马面鲀的头部以及鲑鱼的抗氧化肽的半数有效浓度，因此，能够有效的清除ABTS自由基。作为优选，上述天然寡肽二巯基丙磺酸钠进行处理。疏水性氨基酸能够加强肽与脂质中自由基的相互作用，阻断脂质自氧化的链式反应，寡肽Gln-Tyr上的疏水氨基酸残基可与二巯基丙磺酸钠的疏水基团碳氢链结合，使寡肽的二级有序结构减少，使寡肽的疏水残基进一步暴露，使表面疏水性提高，更容易捕获脂质从而提高寡肽对脂质过氧化的抑制作用。过渡金属离子Fe2+是非常强的自由基发生剂，能够催化形成轻自由基，而二巯基丙磺酸钠有较多的负电荷，与寡肽结合后，寡肽上带有的负电荷增多，提高了其对Fe2+的静电吸引作用，从而提高了抗氧化肽螯合Fe2+的能力，最终提高天然寡肽清除ROS的能力。二巯基丙磺酸钠的浓度更优选为40-6mg/ml，二巯基丙磺酸钠的进一步优选为50mg/ml。上述二巯基丙磺酸钠的处理方式为：配制5-7mg/mL的天然寡肽，加入二巯基丙磺酸钠溶液，在55-65℃水浴条件下处理12-16min，冰浴冷却，用截留分子量为400Da的超滤膜处理，收集滤液，冻干，即得修饰后天然寡肽。本专利技术的另一个目的在于提供本文描述的任一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽的制备方法硅化合物的制备方法，该制备方法增加了蛋白质的溶解性，促进与风味蛋白酶作用的结合位点发生裸露，蛋白质水解度高，释放出分子量较小的抗氧化活性强的目标功能短肽。本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽的制备方法，该天然寡肽由风味蛋白酶对辣木籽蛋白水解后分离纯化得到。就一种蛋白质而言，用不同来源的蛋白酶水解，其水解速率、水解程度以及水解产物的组成有所不同，本专利技术选择风味蛋白酶有利于提高蛋白质的水解效率，获得目标寡肽。作为优选，上述风味蛋白酶酶解前用氨基丁三醇进行预处理。更优选地，取100mL质量体积比为5％(mg/mL)的辣木籽蛋白悬浮液加入3-5mL2-3mmol/mL氨基丁三醇，在室温条件下进行预处理。辣木籽蛋白肽的抗氧化活性与肽的分子量大小有关，辣木籽蛋白水解程度不同，水解得到的抗氧化肽分子量不同，活性也不同。风味蛋白酶酶解时加入一定量的氨基丁三醇，能够对蛋白质侧链上的羧酸敏感基团进行特异性修饰，使蛋白质氨基酸残基和多肽链发生改变，从而引起蛋白质空间结构和理化性质的改变，增加了蛋白质的溶解性，且易被风味蛋白酶作用的结合位点发生裸露，且不会对风味蛋白酶酶解反应产生影响，有利于蛋白质水解，水解度可达48.1％，释放出分子量较小的目标功能短肽。作为优选，上述风味蛋白酶的酶解条件为：温度49-51℃，调节pH至6.5-6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽，是清除细胞内ROS的天然寡肽，分离自辣木籽蛋白水解物，其特征在于：所述天然寡肽的氨基酸序列为Gln‑Tyr，分子量为309.18Da。

【技术特征摘要】
1.一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽，是清除细胞内ROS的天然寡肽，分离自辣木籽蛋白水解物，其特征在于：所述天然寡肽的氨基酸序列为Gln-Tyr，分子量为309.18Da。2.根据权利要求1所述的一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽，其特征在于：所述天然寡肽还具有提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性。3.根据权利要求2所述的一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽，其特征在于：所述天然寡肽对DPPH自由基的半数有效浓度为0.75mg/mL，对ABTS自由基的半数有效浓度为0.33mg/mL。4.根据权利要求1或2或3所述的一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽，其特征在于：所述天然寡肽用二巯基丙磺酸钠进行处理。5.根据权利要求4所述的一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽，其特征在于：所述二巯基丙磺酸钠的处理方式为：配制5-7mg/mL的天然寡肽；加入二巯基丙磺酸钠溶液，在55-65℃水浴条件下处理12-16min；冰浴冷却，用截留分子量为400Da的超滤膜处理，收集滤液；冻干。6.权利要求1-5任一项中所述的一种能够显著清除活性氧(ROS)的天然寡肽的制备方法，其特征在于：所述天然寡肽由风味蛋白酶对辣木籽蛋白水解后分离纯化得到。...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙坤来，梁丽丽，王斌，陈荫，赵玉勤，蔡诗颖，初雪梅，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33