本发明专利技术涉及生物工程技术，提供了基于3D打印框架控制的牵张力调控组织血管分支的方法，具体步骤为：装载PCL注射器，移至3D生物打印机的第一打印架上，将明胶支架材料加入到第二注射器内，移至打印机第二打印架上，将纤维蛋白凝胶和细胞混合物加入到第三注射器内，移至打印机第三打印架上，调整软件和PCL注射器，使用3D生物打印平台构建PCL框架，并在PCL框架上建立凹槽，将明胶支架材料打印填充至PCL框架内，将纤维蛋白凝胶与细胞混合物打印固定于PCL框架上形成条带，然后悬浮于培养基中，通过纤维蛋白回缩和细胞张力所产生的牵张力控制血管的分支形成，从而能够构建预血管化的组织工程组织或器官，解决组织工程组织和器官的缺血问题。
Method of Tissue and Vessel Branch Regulation by Tension Controlled by 3D Printing Frame
【技术实现步骤摘要】
基于3D打印框架控制的牵张力调控组织血管分支的方法
本专利技术涉及生物工程技术，具体涉及基于3D打印框架控制的牵张力调控组织血管分支的方法。
技术介绍
3D打印血管的模式主要有两种，一种是间接打印，一种是直接打印。间接打印是打印一种可牺牲的填充物构建模型支架，溶解后产生管道系统。另一种采用含细胞的生物墨水支架打印血管结构。两种方式的联合应用能更好地制作出符合要求的血管结构。例如：采用直接打印控制细胞的位置构建微米级的毛细血管网络结构，同时采用间接打印的模式制作模型管道，然后灌注细胞，从而构建毫米级的大血管。在微挤压型打印技术的基础上，Gao团队[Biomaterials.2015，61:203-15]专利技术了一种挤出型共轴打印头，分为内外两个管道，内管道可以投放钙盐溶液，而外管道可投放藻朊酸盐溶液，打印出的结构自身携带可灌注的微管道，随着载物台的降低，打印结构浸入到钙盐溶液中进行二次交联。打印精度可达900微米。增加微管道数目可提高细胞的成活率。缺点是虽然藻朊酸提供了直线、生物相容性较好的微挤压打印方法，但由于缺乏自支撑，很难打印出复杂的组织或器官。Kolesky等[AdvMater.2014，26(19):3124-30]采用类似的方式按照既定程序同时打印PluronicF127和混有细胞的Gelatin-methacrylate(GelMA)。包裹在无细胞的GelMA中的打印结构通过光聚合作用交联基质。PluronicF127通道会在温度降低时溶解，随后灌注HUVECs完成血管化组织结构的构建。Miller等[NatMater.2012,11(9):768-74]采用生物打印机以碳水化合物玻璃为支架材料构建3D血管网络，制作完毕后10分钟，灌注35×106cell/ml的HUVECs悬液，培养基中静置1小时，然后继续灌注，1天后HUVECs即可铺整个管道系统。再生血管的功能在以兔肝细胞为主的组织工程组织中得到了验证。现在打印机的细胞打印精度为150-200微米，还不能直接打印出10-20微米的毛细血管网结果[TrendsBiotechnol.2015,33(7):395–400]。但除了打印机的直接调控外，生物墨水在打印过程中或过程后都可以对内皮细胞发育过程进行调控[AdvMater.2014,26(19):3124–30]。Lee等[Biomaterials.2014,35(28):8092-102]在HUVEC-明胶管道周围投放胶原，培养过程中当明胶溶解后，HUVECs会沉降而粘附在周围的胶原管壁上。作为细胞外基质的组成成分的胶原可以促进HUVECs的内皮化，进而增加血管管壁的完整性。Norotte等[Biomaterials.2009,30(30):5910–7]将脐静脉平滑肌细胞及成纤维细胞制作成细胞球，将细胞球与琼脂糖条带一起打印，琼脂糖条带作为打印导板，形成直线或分支装的血管结构。打印结构经培养后细胞球会相互融合形成单层或多层的小直径空腔血管（直接为0.9-2.5mm）。外界张力刺激能够影响组织的血管形成。例如，Levenberg团队以聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)微柱为支撑，对与纤维蛋白原共培养的脐静脉内皮细胞(Humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)和成纤维细胞(Fibroblast，FB)施加一定的牵张力。结果发现血管能够按照牵张力的方向生长，植入动物体内后，血管能够迅速与受区血管建立联系，血液可通过这些血管，并且血管仍能保持其一致的方向性，其认为外界机械力作用对血管生长方向的调控起关键作用。这种外力对血管生成的调控是由改变HUVEC微环境实现的[PNAS2016,113(12):3215-20]。Moore等对胚胎肺研究发现，Rho依赖牵张力诱导的血管形成中，适宜的牵张力可促进血管形成，但过大牵张力不利于血管的形成[DevDyn2005,232(2):268-81]，这说明适当水平的张力刺激对血管的形成非常重要。虽然根据仿生学原理采用3D生物打印机得到的血管结构外形与正常的组织血管非常相似，但因为未对单个的血管内皮细胞进行控制，故其血管内皮细胞的贴壁及血管化程度很难控制，并不能保证内皮细胞生长方向完全按照支架结构的方向生长。因此，这种方式还不能完成临床所需要的血管化组织或器官。组织工程的另一项技术手段-自我组装，依赖于细胞作为组织发生的主要初始因素，通过调节细胞微环境，驱动生物打印组织按照胚胎机制发育来实现组织的发育和成熟，自我组装原理对血管生成的调控是由改变HUVEC微环境实现的，形成的血管是HUVEC自发形成的血管结构，符合生命的发展过程，血管网的结构和功能更为可靠，与实体细胞的联系也更为紧密，将会为组织工程组织或器官的血管化提供可靠的研究思路。
技术实现思路
要解决的技术问题：本专利技术的目的是通过对组织工程组织或器官的微血管化进行控制，从而构建预血管化的组织工程组织或器官，解决组织工程组织和器官的缺血问题。技术方案：本专利技术提供了基于3D打印框架控制的牵张力调控组织血管分支的方法，包括以下步骤：步骤一：建立3D框架结构模型，编辑程序并导入3D生物打印机；步骤二：装载PCL注射器，移至3D生物打印机的第一打印架上；步骤三：将1-2mL明胶支架材料加入到第二注射器内，密封后冰浴20-30min，后移至打印机第二打印架上，放置25-35min；步骤四：将纤维蛋白凝胶和细胞混合物加入到第三注射器内，密封后冰浴20-30min，后移至打印机第三打印架上，放置25-35min；步骤五：调整软件和PCL注射器，使用3D生物打印平台在Petri培养皿中构建PCL框架，并在PCL框架上建立凹槽，调整第二注射器，将明胶支架材料打印填充至PCL框架内，调整第三注射器，将纤维蛋白凝胶与细胞混合物打印固定于PCL框架上形成条带，向Petri培养皿中加入10μL凝血酶，室温下交联30-40min，再于Petri培养皿中加入组织培养基，移至含5%CO2，37℃培养箱中培养30-40min。优选的，步骤三中明胶支架材料的制备方法为：将明胶加入到基础液离心管中，振荡混匀后移至37℃温室内，固定于轮盘式混匀器上，设置转速为8-12rpm/min，时间为15-25min，完毕后，将得到透明的液体移至生物安全柜内，采用0.2μm过滤器进行过滤即得。优选的，步骤四中所述的细胞包括脐静脉内皮细胞和成纤维细胞。优选的，步骤五中PCL注射器的加热器温度为90-95℃，注射压力为680-700Kpa。优选的，步骤五中凹槽的深度为90-110μm。优选的，步骤五中构建的PCL框架是圆形或方形。优选的，步骤五中第二注射器的注射压力为95-120Kpa，温度为18-19℃。优选的，步骤五中第三注射器的注射压力为85-110Kpa，温度为18-19℃。有益效果：本专利技术通过3D生物打印平台构建PCL圆形或方形框架结构，将纤维蛋白-脐静脉内皮细胞和成纤维细胞复合物条带固定于PCL框架上，在纤维蛋白-脐静脉内皮细胞和成纤维细胞复合物条带之间及底层均填充明胶支架材料，然后浸没于组织培养基中，明胶支架材料发生溶解，纤维蛋白-脐静脉内皮细胞和成纤维细胞复合物条带固本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于3D打印框架控制的牵张力调控组织血管分支的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：建立3D框架结构模型，编辑程序并导入3D生物打印机；步骤二：装载PCL注射器，移至3D生物打印机的第一打印架上；步骤三：将1‑2mL明胶支架材料加入到第二注射器内，密封后冰浴20‑30min，后移至打印机第二打印架上，放置25‑35min；步骤四：将纤维蛋白凝胶和细胞混合物加入到第三注射器内，密封后冰浴20‑30min，后移至打印机第三打印架上，放置25‑35min；步骤五：调整软件和PCL注射器，使用3D生物打印平台在Petri培养皿中构建PCL框架，并在PCL框架上建立凹槽，调整第二注射器，将明胶支架材料打印填充至PCL框架内，调整第三注射器，将纤维蛋白凝胶与细胞混合物打印固定于PCL框架上形成条带，向Petri培养皿中加入10μL凝血酶，室温下交联30‑40min，再于Petri培养皿中加入组织培养基，移至含5%CO2，37℃培养箱中培养30‑40min。
【技术特征摘要】
1.基于3D打印框架控制的牵张力调控组织血管分支的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：建立3D框架结构模型，编辑程序并导入3D生物打印机；步骤二：装载PCL注射器，移至3D生物打印机的第一打印架上；步骤三：将1-2mL明胶支架材料加入到第二注射器内，密封后冰浴20-30min，后移至打印机第二打印架上，放置25-35min；步骤四：将纤维蛋白凝胶和细胞混合物加入到第三注射器内，密封后冰浴20-30min，后移至打印机第三打印架上，放置25-35min；步骤五：调整软件和PCL注射器，使用3D生物打印平台在Petri培养皿中构建PCL框架，并在PCL框架上建立凹槽，调整第二注射器，将明胶支架材料打印填充至PCL框架内，调整第三注射器，将纤维蛋白凝胶与细胞混合物打印固定于PCL框架上形成条带，向Petri培养皿中加入10μL凝血酶，室温下交联30-40min，再于Petri培养皿中加入组织培养基，移至含5%CO2，37℃培养箱中培养30-40min。2.根据权利要求1所述的基于3D打印框架控制的牵张力调控组织血管分支的方法，其特征在于，步骤三中明胶支架材料的制备方法为：将明胶加入到基础液离心管中，振荡混匀后移至37℃温...
【专利技术属性】
技术研发人员：张广亮，
申请(专利权)人：苏州瑞兴手外科技术应用研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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