抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株HIRRV‑G‑4D10，保藏号为：CCTCC NO：C201869，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2018年3月29日的杂交瘤细胞分泌的。所述单抗经间接酶联免疫反应实验证明能与浓缩的病毒发生特异性结合，微量病毒中和测定实验结果显示，单抗HIRRV‑G‑4D10对HIRRV具有中和活性，可显著降低感染牙鲆弹状病毒的EPC细胞的病变效应。免疫印迹结合质谱分析结果显示：本发明专利技术的单抗能特异性识别60 kDa的天然牙鲆弹状病毒G蛋白。间接免疫荧光显示，单抗HIRRV‑G‑4D10可与感染牙鲆弹状病毒的EPC细胞发生特异性反应，荧光信号主要分布在细胞膜和细胞质中。本发明专利技术的单克隆抗体可用于制备抗牙鲆弹状病毒的免疫制剂和牙鲆弹状病毒的检测试剂。

Monoclonal antibodies against Paralichthys olivaceus rhabdovirus G protein and their preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种单克隆抗体及其制备方法，具体涉及一种具有中和活性的抗牙鲆弹状病毒的单克隆抗体及其制备方法与应用，属于免疫学和病毒学交叉

技术介绍
牙鲆弹状病毒（HIRRV）是水产养殖鱼类一种重要的病毒性病原，具有强烈的致病性，该病毒可感染牙鲆、香鱼、石鲽、鲈、河鳟等多种海淡水经济鱼类。当水温在10℃左右时该病容易暴发流行，可引起感染鱼体较高的死亡率，对水产鱼类的健康养殖产生严重的威胁。因此，研制特异性识别HIRRV的单克隆抗体可应用于疾病的快速诊断检测、致病机制研究以及抗病生物分子的开发等方面，具有重要的理论与实际应用价值。牙鲆弹状病毒基因组由一条单链负义RNA组成，可编码5种结构蛋白，分别为核蛋白(N)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，糖蛋白(G)，和RNA聚合酶(L)。其中，G蛋白是组成牙鲆弹状病毒的主要结构蛋白，在病毒表面形成三聚体，它与细胞膜受体结合并介导病毒入胞。该蛋白含有多个抗原位点，具有很强的抗原性，可诱导鱼体产生中和抗体。因而，以牙鲆弹状病毒G蛋白为靶抗原，研制其特异性单抗，对于筛选病毒中和性单抗及研究HIRRV侵染机制具有更为重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具病毒中和活性的抗牙鲆弹状病毒单克隆抗体及其制备方法。本专利技术的目的是由以下技术方案实现的：一种抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株HIRRV-G-4D10，保藏号为：CCTCCNO：C201869，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为：2018年3月29日的杂交瘤细胞分泌的。与所述的单克隆抗体发生特异性结合的抗原决定簇位于牙鲆弹状病毒G基因片段（61-1524nt）基因编码的多肽区域。一种所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：首先，利用Trizol法提取弹状病毒总RNA反转后获得cDNA，以cDNA产物为模板，PCR扩增G基因片段（61-1524nt），连接pET-28a载体构建重组表达质粒pET-28a-G，将其导入感受态大肠杆菌后经诱导表达、亲和层析纯化获得重组G蛋白，以亲和纯化的重组G蛋白作为抗原免疫Balb/c小白鼠，采用细胞融合法制备杂交瘤细胞，通过微量中和实验和免疫学检测筛选方法，筛选到分泌具有病毒中和活性的抗牙鲆弹状病毒G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株HIRRV-G-4D10，采用常规方法扩大培养上述所得到的杂交瘤细胞株，收集细胞培养上清液，经纯化后得到抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体。所述的免疫学检测筛选方法是：间接酶联免疫法，转印免疫印迹法和间接免疫荧光法。其中所述的间接酶联免疫法和转印免疫印迹法综合确定该单抗与牙鲆弹状病毒G蛋白特异性结合反应真实存在；所述的转印免疫印迹法确定该单抗的抗原决定簇位于牙鲆G基因片段（61-1524nt）基因编码的多肽区域。本专利技术的单抗经间接酶联免疫反应实验结果显示单抗能与浓缩的病毒发生特异性结合，转印免疫印迹与质谱分析结果显示：本专利技术的单克隆抗体能特异性识别牙鲆G基因片段（61-1524nt）基因编码的重组蛋白以及分子量为60kDa的天然牙鲆弹状病毒G蛋白。间接免疫荧光检测显示，单克隆抗体可以与感染24h后的EPC细胞特异性地反应，荧光信号在病毒受感的细胞膜和细胞质中均有分布。在倒置显微镜下观察，生长状态良好的该杂交瘤细胞分裂旺盛、外观饱满、浑圆、折光性强、细胞大小均一、贴壁良好；该杂交瘤细胞有无限分裂增生能力；长势良好的该杂交瘤细胞常规培养2-3天，其培养基由桃红色转变为黄色，该培养基中含有该杂交瘤细胞分泌的大量的抗牙鲆弹状病毒G蛋白单克隆抗体。所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体在制备抗牙鲆弹状病毒免疫制剂中的应用。所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体在制备牙鲆弹状病毒检测试剂中的应用。本专利技术的优点：本专利技术制备的抗牙鲆弹状病毒G蛋白单克隆抗体，可用于HIRRV感染阻断试剂开发以及HIRRV的常规检测，对于预防水产鱼类中HIRRV的爆发具有重大的应用价值，进而保障了水产养殖的安全性。本专利技术的制备方法是通过基因重组表达获得重组牙鲆弹状病毒G蛋白，以重组蛋白作为抗原免疫小鼠，采用细胞融合制备杂交瘤细胞，通过微量中和实验测定了牙鲆弹状病毒G蛋白单克隆抗体的中和效果，再经过免疫学检测方法筛选出抗牙鲆弹状病毒G蛋白单克隆抗体，这样的制备技术路线设计新颖，严密而合理。附图说明图1为在大肠杆菌中表达的弹状病毒重组G蛋白的SDS-PAGE图。泳道M表示标准分子量蛋白；泳道1表示无IPTG诱导的阴性对照；泳道2表示IPTG诱导的重组pET-28a-G转染的大肠杆菌；泳道3表示纯化的重组G蛋白。图2为单克隆抗体HIRRV-G-4D10的病毒微量中和测定实验图。弹状病毒感染EPC细胞后，HIRRV-G-4D10和对照组分别表示单克隆抗体HIRRV-G-4D10和骨髓瘤细胞培养上清与病毒孵育后感染细胞后不同时间点的细胞病变情况。图3为单克隆抗体对重组G蛋白的免疫印迹分析图。泳道M表示标准分子量蛋白；泳道1表示纯化的牙鲆弹状病毒的SDS-PAGE；泳道2：单克隆抗体HIRRV-G-4D10与纯化的牙鲆弹状病毒的免疫反应结果；泳道3：阴性对照。图4为抗牙鲆弹状病毒的单克隆抗体HIRRV-G-4D10特异性识别的60kDa病毒蛋白质的质谱图。方框内序列是与弹状病毒G序列一致的肽段。图5为利用单克隆抗体HIRRV-G-4D10结合间接免疫荧光技术检测感染HIRRV的EPC细胞免疫荧光结果。具体实施方式下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本专利技术。实施例1：构建表达牙鲆弹状病毒G蛋白质粒与蛋白表达（1）以Trizol法抽提弹状病毒的总RNA。（2）根据引物设计原则及公布的一种牙鲆弹状病毒分离株CNPo2015的G基因（GeneBank：KY363350），利用引物设计软件Primer5.0，结合pET28(a)质粒的多克隆位点的特点，选择BamHI和XhoI的酶切位点处作为目的基因的插入位置，设计牙鲆弹状病毒G蛋白表达引物：上游引物：5’-GAGAATTCCAAACCATCAAGCCTGGAG-3’；下游引物：5’-GAGTCGACTCGACTGGCGAGGTGGT-3’。（3）以提取的总RNA为模板，先逆转录合成cDNA第一链，然后进行常规PCR扩增，反应条件：95℃，5min；94℃变性20s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；然后72℃延伸10min，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，利用DNA片段回收试剂盒对目的基因进行纯化回收。（4）将质粒pET28(a)和纯化回收的PCR扩增产物分别用限制性内切酶BamHI和XhoI进行双酶切，使用T4DNA连接酶对酶切产物进行连接,连接后构建质粒pET28a-G。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，待长出的菌落，使用T7通用引物，采用菌落PCR法筛选阳性菌，并进行测序验证。（5）将阳性克隆菌和含pET28a空载体的菌株放入含卡那霉素的LB液体培养基中37℃过夜振荡培养，次日按1:100稀释培养过夜的菌液，继续培养至菌液OD600=0.4-0.6时，加入异丙基硫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株HIRRV‑G‑4D10，保藏号为：CCTCC NO：C201869，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为：2018年3月29日的杂交瘤细胞分泌的。

【技术特征摘要】
1.一种抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株HIRRV-G-4D10，保藏号为：CCTCCNO：C201869，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为：2018年3月29日的杂交瘤细胞分泌的。2.如权利要求1所述的抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的抗原决定簇位于牙鲆G基因片段（61-1524nt）基因编码的多肽区域。3.如权利要求1所述的抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗抗能特异性识别60kDa的天然牙鲆弹状病毒G蛋白。4.一种如权利要求1所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：利用Trizol法提取弹状病毒总RNA反转后获得cDNA，以cDNA产物为模板，PCR扩增G基因片段（61-1524nt），连接...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐小千，战文斌，张家林，绳秀珍，邢婧，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37