本发明专利技术属于分子生物学领域，基于靶分子配体和核酸配基的分子识别，结合磁分离纯化，通过质谱的分子定性定量分析，实现多分子组检测和多功能组信息的统一，能检测出机体或组织的分子组和功能组的相关性。本发明专利技术利用磁分离简单完成靶分子组的分离；利用适配体的特异性和高亲和性可有效获得靶分子组；质谱有效的进行多分子的定性定量，实现二次分子检测，提高检测的准确性；多分子的统一定性定量可较真实的反应分子间的相互关系，同时也揭示机体功能的相互关系，利于蛋白质组学和基因组学研究与临床分子检测。
Method and Kit for Simultaneous Detection of Magnetic Bead-Nucleic Acid Adaptor-Multi-Target Molecule
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】磁珠-核酸适配体-多靶分子同时检测的方法及试剂盒
本专利技术涉及磁珠-核酸适配体-多靶分子同时检测的方法及试剂盒，尤其是涉及一种通过多分子样品的标志物核酸适配体组捕捉样品中的标志物分子利用激光解析飞行质谱对检测标志物进行定性定量，再利用数据平台的分析处理得到样品综合体系的检测分析结果，具体的说是涉及对样品整体特征分子检测和综合体系分析。
技术介绍
早期蛋白质检测是以抗体同特定待检物蛋白质的低解离常数和一定的特异性为基础，抗体捕捉方法是简易方便的筛选方法。抗体捕捉法中，抗原包被于固相支持物，然后用抗体去结合抗原，洗板去掉未结合的抗体，最后用和结合抗体特异识别的标记分子去检测结合抗体，许多抗体捕捉法是利用间接法来检测抗体。例如，检测抗体是鼠抗体，检测分子可能是带检测标记的兔抗鼠抗体。传统的检测标记包括放射性同位素，染料和作用于底物产生可检测分子如色原的酶。抗原捕捉检测法是检测样品中有无抗原。首先抗体先结合到支持物上，然后抗原加入和抗体反应形成复合物，最后检测复合物。也可以抗原抗体先反应形成复合物后，再结合到固相支持物上，然后检测复合物。ELISA是广为人知的免疫检测法，1971年一问世，就启动了诊断方法的革命，传统的ELISA技术似三明治夹心法，即两抗体共同结合到某一抗原。捕捉抗体同样品中的抗原结合，再加入同抗原结合的偶联酶的检测抗体反应形成捕捉抗体—抗原—检测抗体“三明治”复合物，最后测偶联酶活性显示检测结果。抗体检测法具有较大的应用价值，但是他的检测范围受捕捉抗体和抗原反应的Kd值限制，在实践中，检测底线大约是Kd值的1％，当待分析物浓度降低到这个可能检测限时，捕捉到待分析物抗体百分率不足以产生相对于信噪比的可检测信号。因此，用荧光或化学发光检测系的抗体检测法的检测下限约1pg/ml(10-4M对平均分子量50，000道尔顿的蛋白质)。核酸与蛋白质在细胞内相互作用是普遍现象。核酸能折叠形成二级结构和三级结构，这对其与蛋白质相互结合作用非常重要。通过使核苷酸序列多样化而使体外检测核酸蛋白质相互作用方法成熟。SELEX技术被用来分离所选靶标的核苷酸配体，这些配体被称为配基或适配体，意即核酸可以形成一定结构并适配入靶分子的口袋，SELEX技术就是利用该原理筛选靶分子配基的方法。Gold等在1995年(GoldL，etal.AnnuRevBiochem,64:763--797)应用SELEX筛选出的系统性红斑狼疮特异抗体的RNA和ssDNA配基，不仅对系统性红斑狼疮进行诊断，而且进行病情监测和疗效检验。Gold等又在1999年(GoldL，etal.DiagnDec；4(4):381-8)在配基微阵分子诊断应用研究中,对配基微阵分辨率进行研究,均显出核酸配基检测有巨大的应用前景。但是目前的配基检测都是采用直接对配基PCR扩增放大检测的方法。这种方法操作复杂，需要将配体和配基分离，且灵敏度低(由于配体和配基分离后，配基纯度及残留配体和配基的再结合阻断DNA复制)和准确性差。SELEX技术开始后，许多靶标的核苷酸配基已被筛选出，尤其是已知能和核酸结合的许多蛋白质可作为SELEX技术的较合适靶标，如T4DNA聚合酶、噬菌体R17被膜蛋白，大肠杆菌rho因子，大肠杆菌核糖体蛋白S1，苯丙氨酸-tRNA合成酶，识别RNA的自身免疫抗体，E2F转录因子，不同的HIV相关蛋白。SELEX技术可筛选出许多不同蛋白配基的事实引发了配基应用的拓展，可作为单抗和多抗产品的替代品应用于诊断和治疗。配基代替抗体应用于诊断已显示其价值。DNA聚合酶的配基已被用于热启动PCR来诊断低拷贝的复制子，提高PCR敏感性和保真性。配基也被用于促进实验方法。中性弹性蛋白的酶配体荧光标记后用于流式细胞仪检测弹性酶浓度，中性弹性蛋白酶配基尚用于鼠肺炎症诊断模型体内诊断。在酶联寡核苷酸方法(ELDNA)中，一个或多个抗体被对抗原有高亲和力高特异性的配基取代。这样的配基可通过SELEX技术体外筛选获得，见美国专利WO96/40991和WD97/38134描述了酶联寡核苷酸方法，其中用核苷酸配基代替夹心法中的检测抗体或捕捉抗体。通常，夹心法用传统的酶联检测抗体检测捕捉分子-抗原复合物，然而用报告酶分子标记寡核苷酸，这需要化学合成步骤和额外的劳动。上述用抗体试剂的方法本身也存在着困难。上两个专利中也提到捕捉分子-靶分子-检测分子复合物中核酸配基PCR扩增检测系统；利用常用报告分子如酶、生物素等的PCR引物来扩增扩增子，这样做是提高了配体的数量，但是也带来了不利：需进一步把扩增的配基和不纯的核苷酸引物二聚体分离。传统的凝胶分离需大量人工劳作。DNA和RNA配基都存在着这样的问题。用标记的引物不能解决不纯问题和引物二聚体扩增问题，因此，无法定量。尽管上述进步显著，但诊断方法仍需提高灵敏度，减少人工操作，改进动态监测以便快速分析样品中靶标的存在与否及对其定量。MALDI-TOFMS是近年来发展起来的一种软电离新型有机质谱。已成为检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多种合成聚合物的强有力工具，原理是:当用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质量电荷之比与离子的飞行时间成正比来检测离子。MALDI-TOF-MS的中心技术就是依据样品的质荷比(m/z)的不同来进行检测，并测得样品分子的分子量。根据MALDI-TOFMS的原理，MALDI-TOFMS具有灵敏度高、准确度高、分辨率高、图谱简明、质量范围广及速度快等特点，在操作上制样简便、可微量化、大规模、并行化和高度自动化处理待检生物样品，而且在测定生物大分子和合成高聚物应用方面有特殊的优越性。近年来已成为检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多种合成聚合物的强有力工具。如应用MALDI-TOFMS测定蛋白质酶解的肽质量指纹图谱(PMF)、源后裂解(PSD)碎片离子图谱、并结合质谱网络数据库检索，可获得多肽、蛋白质的序列。应用MALDI-TOFMS对基因组单核苷酸多态性(SNPs)进行分析检测，可区分和鉴别相对分子质量达7,000左右(含20多个碱基)、仅存在1个碱基差别的不同DNA。特别值得指出的是，MALDI-TOFMS已成为生命科学领域蛋白质组研究中必不可缺的重要关键技术之一。随着科学技术的快速发展，尤其是大数据处理技术的进步，只要有足够的数据信息量，就能促进类似人体分子功能机制的深入了解和应用。
技术实现思路
血清肿瘤标志物的检测可作为一种非介入性的诊断方法，在肿瘤诊断中发挥着重要作用，因此，建立一种简单、快捷、灵敏、便于动态检测的血清肿瘤标志物组的诊断方法，是肿瘤早期诊断和防治的关键。本专利技术的目的在于提出涉及可以利用核酸配基组钓到检测液中的标志物组，并分离得到标志物组，再通过MALDI-TOFMS和生物信息学等，对标志物组进行定性、定量和组学分析的相关方案，可用于血清和体液等复合样品检测。本专利技术的一种方案通过以下技术方案实现：一种磁珠-适配体-多靶分子同时检测的方法，用于多标志物同时检测分析，该方法包括下述步本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种磁珠‑适配体‑多靶分子同时检测的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)孵育：磁珠‑适配体和标本一起孵育，形成磁珠‑适配体‑靶分子复合物；(2)酸洗脱：加入洗脱缓冲液,晃动，收集洗脱液，立即加入内含有检测靶分子的标准肽段的TrisHCL中和；(3)质谱定性定量检测指定的靶分子；(4)通过数据平台分析系统进行分析。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种磁珠-适配体-多靶分子同时检测的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)孵育：磁珠-适配体和标本一起孵育，形成磁珠-适配体-靶分子复合物；(2)酸洗脱：加入洗脱缓冲液,晃动，收集洗脱液，立即加入内含有检测靶分子的标准肽段的TrisHCL中和；(3)质谱定性定量检测指定的靶分子；(4)通过数据平台分析系统进行分析。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述标本包括血清、尿液、体液，以及细胞和组织悬液中的至少一种。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的适配体是针对所述标本利用指数富集的配基系统进化技术筛选获得的特异性核酸适配体组。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中酸洗脱分离适配体和靶分子的洗脱效率为98％以上。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述标准肽段是指为准确对指定蛋白肽段进行定性定量，在质谱样本中带进的参照标准肽段。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述靶分子是经过实验筛选获得的具有特异性标志的靶分子。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)根据检测到的指定蛋白的量效关系而推测功能机制，作出分析报告。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述标本通过以下方法制备：按静脉穿刺法采取所需血量，立即卸下针头，将血液注入盛有抗凝剂的试管内，立即轻轻摇动，使血液和抗凝剂混匀，以防血液凝固，然后在3000-6000转/min下离心，分离血清即得。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述磁珠-适配体-靶分子复合物通过以下方法形成：将100μL所述标本与50μL所述磁珠-适配体一起37℃孵育30分钟，经3χSSC洗涤一次，20倍体积的0.4mMBindingBuffer洗涤3次，磁分离即得。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，包括以下步骤：在步骤(1)所述磁珠-适配体-靶分子复合物中加入0.5ml洗脱缓冲液,晃动...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖世奇，曾家豫，廖正宇，栗怡，袁红霞，魏正丽，
申请(专利权)人：廖世奇，
类型：发明
国别省市：甘肃,62
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