基于噬菌体的疏螺旋体属病的检测及其方法技术

本发明专利技术涉及检测广义伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensu lato)的方法或用于检测与回归热(RF)相关的疏螺旋体属(Borrelia)的方法、用于进行这样的方法的试剂盒和治疗受试者中的广义伯氏疏螺旋体或RF感染的方法。还提供了对疏螺旋体属特异性的噬菌体的用途。

Detection and Method of Spirochaete Diseases Based on Phage

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于噬菌体的疏螺旋体属病的检测及其方法专利
本专利技术涉及检测广义伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferisensulato)或用于检测与回归热(RelapsingFever)(RF)相关的疏螺旋体属(Borrelia)的方法、用于进行这样的方法的试剂盒和治疗受试者中的广义伯氏疏螺旋体或RF感染的方法。还提供了对疏螺旋体属特异性的噬菌体的用途。背景广义(s.l.)伯氏疏螺旋体是螺旋体门的疏螺旋体属的一组细菌物种，并且其已知是莱姆病(LD)中的病原体。在广义(s.l.)伯氏疏螺旋体中，在欧洲的莱姆病患者中通常被发现的三种主要物种是狭义伯氏疏螺旋体(B.burgdorferisensustricto(s.s.))、阿氏疏螺旋体(B.afzelii)和伽氏疏螺旋体(B.garinii)。而狭义伯氏疏螺旋体在美国和在欧洲都引起LD。其他较不经常遇到的LD物种包括斯氏疏螺旋体(Borreliaspielmanii)、法雷斯疏螺旋体(Borreliavalaisiana)、比塞蒂疏螺旋体(Borreliabissettii)、卢西塔尼亚疏螺旋体(Borrelialusitaniae)、芬兰疏螺旋体(Borreliafinlandensis)、巴伐利亚疏螺旋体(Borreliabavariensis)、日本疏螺旋体(Borreliajaponica)、西尼伽疏螺旋体(Borreliasinica)、斯氏疏螺旋体(Borreliaspielmanii)、塔卢基疏螺旋体(Borreliatanukii)、土德疏螺旋体(Borreliaturdi)、BorreliaYangtze、梅奥疏螺旋体(Borreliamayonii)、Borreliacarolinensis、安德森疏螺旋体(Borreliaandersonii)、孤星疏螺旋体(Borrelialonestari)和美国疏螺旋体(BorreliaAmericana)。引起LD的细菌通过被细菌感染的蜱的叮咬(并且较不频繁地通过其他昆虫)传播至人类。在美国这是最经常报告的蜱媒疾病，并且疾病控制和预防中心(CDC)每年记录大约30000个证实的LD病例。然而，根据CDC，每年疑似的疏螺旋体属感染的数目是约300000个。在欧洲，过去20年来，LD病例的数目已经稳步地增加，估计每年约85000例。在英格兰和威尔士，据估计每年约3000个新的LD的病例被诊断。临床诊断LD通常是有问题的，因为LD的症状容易与其他疾病混淆。感染的表现的范围可以从明显的皮疹、疲劳、肌肉疼痛、头痛到严重的关节炎、神经状况和心脏状况。因此，疏螺旋体属感染的基于实验室的确定在LD诊断中发挥关键作用。目前的基于实验室的诊断方法集中在基于对该细菌的人类免疫应答间接地确定患者的身体中存在或不存在该细菌。直接检测患者中疏螺旋体属的存在的当前的方法的灵敏度低，并且因此被认为无诊断价值。与所有已知方法学相关的第一个问题是由于这样的事实的结果，即细菌仅在感染的早期容易地从血液样品可得到。在感染的晚期，细菌倾向于迁移至神经系统，在神经系统它们可以保持隔离(remainsequestered)，并且难以用常规诊断工具定位和鉴定。因此，在晚期通过试图检测细菌的存在来鉴定感染通常必须包括脑脊液或类似物的分析，而不是更简单的血液样品的分析。用于鉴定细菌的存在的目前的“金标准”技术包括使来自疑似感染莱姆病的个体的样品的悬浮细菌培养物生长，并且之后表征该培养物中的细菌。通常，表征基于细菌的形态学特征的显微术评估。然而，在已经从培养物获得足够地大和发育的培养的群体以证实细菌的存在前，使培养物生长需要长达7周。即便如此，这样的测试也不能够区分莱姆病和其他蜱媒细菌感染。例如，与回归热(RF)相关的细菌形态学上类似于引起LD的细菌。LD和RF也具有重叠的临床症状。因此，当事实上患者患有RF时，该患者可能通过该方法被诊断为患有LD；这是一个问题，因为治疗方法学对于每种疾病可能不同。第二种诊断方法学包括基于抗体的程序。对被感染的宿主的自身抗体(所述自身抗体作为宿主中对感染的免疫应答的一部分而产生)(即免疫应答抗体)特异性的抗体(即诊断抗体)被用于检测存在或不存在感染。然而，不幸的是，此类基于抗体的方法学仅具有短的机会窗口以精确地鉴定感染的存在。在LD的早期(感染后2-3周)，宿主中作为其对感染的自身免疫反应的一部分的抗体应答通常地不足以发展成被诊断抗体清楚地检测。在晚期LD中，免疫应答抗体的产生被细菌抑制，并且因此再次，抗体信号可能太弱而不能以合理的精确度被检测。因此，估计基于抗体的诊断方法错误地将54％的患者鉴定成未被感染的。第三种已知的诊断方法包括细菌的基于PCR的检测。由于患者的样品中通常极低的相关细菌的浓度，这类方法具有不良的灵敏度的水平。已经计算出，在美国，当患者的脑脊液样品被测试时，仅三分之一的患有LD的患者显示出阳性PCR结果。处于LD的早期的一半的患者显示出对于在血液样品中的细菌的存在的阴性PCR得出的结果。作为目前的诊断和治疗LD的困难的实例，兽医学专业人员报告被他们使用的和基于使用诊断抗体的测试通常地提供对于在马中的广义伯氏疏螺旋体感染的大量的假阳性结果。结果，通常地认可大量的马被不必要地用抗生素诸如土霉素治疗。因此，存在对于检测LD的病原体广义伯氏疏螺旋体的存在的替代方法的需要。由于诊断回归热(其也由疏螺旋体属物种引起，并且经常被错误地诊断为LD，并且反之亦然)面临的类似的困难，还存在对于检测疏螺旋体属的存在的替代方法的需要，疏螺旋体属是回归热的病原体(本文中被称为回归热疏螺旋体属(RF疏螺旋体属))，诸如宫本疏螺旋体(Borreliamiyamotoi)和赫姆斯疏螺旋体(Borreliahermsii)。专利技术概述噬菌体(bacteriophage)(或噬菌体(phage))是可以感染细菌并在细菌中增殖的病毒。通常，它们由包裹在蛋白质外壳(即衣壳)中的核酸的核组成。感染广义伯氏疏螺旋体和RF疏螺旋体属的噬菌体被了解得非常少。缺乏关于疏螺旋体属噬菌体的研究努力/产出主要是由于以下两个障碍。首先，在体外生长疏螺旋体属菌株需要复杂的培养基以模拟其体内条件。这伴有对高度熟练的、“专门训练的”科学家的需求，这些科学家需要拥有关于疏螺旋体属和噬菌体二者的良好的专业知识水平，意味着关于疏螺旋体属噬菌体的学术输出已经被抑制。其次，通常使用的噬菌体表征方法，诸如噬斑测定，不能简单地转化为疏螺旋体属噬菌体研究，因为疏螺旋体属先前没有被观察到在固体琼脂表面上生长以形成可以在其上观察噬菌体的融合细胞生长(confluentcellgrowth)。本专利技术人认为他们是第一个持续地生长疏螺旋体属的有活力的菌苔的人，在所述疏螺旋体属的有活力的菌苔上可以进行疏螺旋体属噬菌体的研究。对于适用于在检测存在或不存在细菌感染中使用的剂，该剂应该能够特异性鉴定与感染相关的细菌。有益地，该剂应该还能够以尽可能最小的侵入方式检测细菌感染。迄今为止，噬菌体还没有被表明在鉴定存在或不存在广义伯氏疏螺旋体感染中是有用的。即使它们已经被表明是有用的，由于对已知感染广义伯氏疏螺旋体的噬菌体的有限的了解，存在的信息不足以确定噬菌体是否可以在这类诊断方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定样品中存在或不存在广义伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensu lato)或回归热疏螺旋体属(Borrelia)的方法，所述方法包括以下步骤：a)检测所述样品中存在或不存在对广义伯氏疏螺旋体或回归热疏螺旋体属特异性的噬菌体；和b)在检测到所述噬菌体的基础上确定所述样品中存在广义伯氏疏螺旋体或回归热疏螺旋体属，或在没有检测到所述噬菌体的基础上确定所述样品中不存在广义伯氏疏螺旋体或回归热疏螺旋体属。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.03 GB 1618565.41.一种确定样品中存在或不存在广义伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferisensulato)或回归热疏螺旋体属(Borrelia)的方法，所述方法包括以下步骤：a)检测所述样品中存在或不存在对广义伯氏疏螺旋体或回归热疏螺旋体属特异性的噬菌体；和b)在检测到所述噬菌体的基础上确定所述样品中存在广义伯氏疏螺旋体或回归热疏螺旋体属，或在没有检测到所述噬菌体的基础上确定所述样品中不存在广义伯氏疏螺旋体或回归热疏螺旋体属。2.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述噬菌体包括检测噬菌体基因或基因片段。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤a)之前是从所述样品分离核酸的步骤，并且步骤a)是对所分离的核酸实施的。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述噬菌体基因或基因片段编码末端酶、穴蛋白、内溶菌素、整合酶、门蛋白或衣壳蛋白或其组合。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述噬菌体基因或基因片段编码末端酶蛋白。6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述噬菌体基因包含根据以下序列的核酸：a)SEQIDNO.1-34；或与SEQIDNO.1-34具有大于或等于70％-99.5％序列同源性的核酸；或其片段；或其中所述噬菌体基因能够编码根据SEQIDNO.36-69的任何一种的蛋白质或其片段；或b)SEQIDNO.84、SEQIDNO.86或SEQIDNO.97-103；或与SEQIDNO.84、SEQIDNO.86或SEQIDNO.97-103具有大于或等于70％-99.5％序列同源性的核酸；或其片段；或其中所述噬菌体基因能够编码根据SEQIDNO.85、SEQIDNO.87或SEQIDNO.104-110的任何一种的蛋白质或其片段。7.根据权利要求6所述的方法，其中所检测的噬菌体基因片段包含SEQIDNO.35；或与SEQIDNO.35具有大于或等于70％-99.5％序列同源性的核酸。8.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述噬菌体包括检测噬菌体蛋白质或其片段。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述噬菌体蛋白质包含以下氨基酸序列：a)SEQIDNO.36-69或由根据SEQIDNO.1-34的基因编码；或与SEQIDNO.36-69中的任一个具有70％-99.5％序列同源性的氨基酸序列或由与SEQIDNO.1-34中的任一个具有70％-99.5％序列同源性的基因编码；或由根据SEQIDNO.35的基因片段编码；或b)SEQIDNO.85、SEQIDNO.87或SEQIDNO.104-110，或由根据SEQIDNO.84、SEQIDNO.86或SEQIDNO.97-103的基因编码；或与SEQIDNO.85、SEQIDNO.87或SEQIDNO.104-110中的任一个具有70％-99.5％序列同源性的氨基酸序列；或由与SEQIDNO.84、SEQIDNO.86或SEQIDNO.97-103具有70％-99.5％序列同源性的基因编码。10.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述噬菌体包括检测噬菌体RNA或RNA片段。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是血浆、全血、脑脊液、尿液、粪便物质、皮肤、脑组织、神经胶质细胞、淋巴、汗液、羊膜液或其任何组合。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是已经在广义伯氏疏螺旋体或回归热疏螺旋体属感染的早期或晚期获得的样品。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述广义伯氏疏螺旋体可以是以下中的任一种或其任何组合：阿氏疏螺旋体(Borreliaafzelii)、斯氏疏螺旋体(Borreliaspielmanii)、法雷斯疏螺旋体(Borreliavalaisiana)、伽氏疏螺旋体(Borreliagarinii)、芬兰疏螺旋体(Borreliafinlandensis)、狭义伯氏疏螺旋体(Borreliabugdorferisensustricto)、比塞蒂疏螺旋体(Borreliabissettii)、巴伐利亚疏螺旋体(Borreliabavariensis)、日本疏螺旋体(Borreliajaponica)、卢西塔尼亚疏螺旋体(Borrelialusitaniae)、西尼伽疏螺旋体(Borreliasinica)、斯氏疏螺旋体(Borreliaspielmanii)、塔卢基疏螺旋体(Borreliatanukii)、土德疏螺旋体(Borreliaturdi)、法雷斯疏螺旋体(Borreliavalaisiana)、BorreliaYangtze、梅奥疏螺旋体(Borreliamayonii)、Borreliacarolinensis和安德森疏螺旋体(Borreliaandersonii)、孤星疏螺旋体(Borrelialonestari)和美洲疏螺旋体(BorreliaAmericana)。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述回归热疏螺旋体属可以是以下中的任一种或其任何组合：宫本疏螺旋体(Borreliamiyamotoi)、赫姆斯疏螺旋体(Borreliahermsii)、回归热疏螺旋体(Borreliarecurrentis)、麝鼩疏螺旋体(Borreliacrocidurae)、中非疏螺旋体(Borreliaduttoni)、西班牙疏螺旋体(Borreliahispanica)、帕...

【专利技术属性】
技术研发人员：丽贝卡·简·玛莎·克洛奇，单金玉，路易斯·查尔斯·特利埃斯，
申请(专利权)人：莱斯特大学，菲利克斯研究与发展有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB