【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于确定头颈部鳞状细胞癌的方法描述本专利技术涉及一种基于测量特定基因集的CpG/CpG岛的超甲基化和/或低甲基化水平,确定头颈部鳞状细胞癌,优选地在早期,的体外进行的方法。背景口腔癌和咽癌合在一起,是世界上第六大常见癌症。每年估计发病率为约60万,这些病例中的三分之二发生在发展中国家。这些肿瘤的死亡率保持不变(在诊断后5年内为50%),并且主要与吸烟和酒精摄入相关。口腔癌患者通常在晚期被诊断,这与较差的预后和较高的放疗和化疗发病率相关。此外,患者的生活质量受到极大的损害,因为外科疗法通常包括毁伤,这通常对吞咽、言语和身体外观具有显著的影响。特别地,口腔鳞状细胞癌(OSCC)是最常见的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC-影响头颈部区域的赘生性疾病),并且通常在口腔癌前病变(OPML)之前。OPML的临床特征和组织学特征不能够提供识别病变的足够信息,导致在随访期间经受恶性转化并发展OSCC的高风险。此外,受OSCC影响的患者可以发展第二原发性OSCC,发生率范围为在17%和30%之间。虽然口腔容易被检查触及,但是若干因素限制了OPML的识别和早期治疗。为此目的,目前用于筛查和检测的金标准是由保健专业人员在常规牙科或体检中进行口外和口内检查期间的视觉和触觉触诊。然而,该疾病在其最早期不容易识别,并且经常躲避医学和牙科专业人员,因为它可能是“隐匿的”,或者隐藏在普通视野之外。事实上,看起来正常的组织通常可能将真相隐藏在黏膜表面下方的细胞中。如果疾病在最早期(I期或II期)被识别--用于识别的理想时间是发育异常的细胞能够突破基底膜之前--则总体五年存活率大于80%。不幸地, ...
【技术保护点】
1.用于检测和/或预后头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的方法,所述方法包括以下步骤:(i)从个体获得分离的生物样品;(ii)从所述样品纯化基因组DNA;(iii)用亚硫酸氢盐,优选地亚硫酸氢钠,处理所述基因组DNA;(iv)在步骤(iii)之后,通过使用至少一个引物对来扩增所述基因组DNA,所述引物对允许扩增选自以下的至少一个基因的基因组DNA区域的至少一个序列:EPHX3、KIF1A、LRRTM1、FLI1、ITGA4、LINC00599、NTM、PARP15、ZAP70、miR193、miR296、GP1BB、hTERT及其任何组合,所述序列包含至少一个CpG和/或CpG岛;(v)测量落入根据步骤(iv)扩增的并且属于以下基因集的序列中的至少一个CpG和/或CpG岛的甲基化水平:a)人类TERT和KIF1A;和/或b)LRRTM1、PARP15、ZAP70、miR193、miR296、hTERT;和/或c)KIF1A、LRRTM1、ZAP70、miR193、miR296、hTERT;和/或d)KIF1A、LRRTM1、FLI1、LINC00599、PARP15、ZAP70、miR19 ...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.04 IT 1020160001111741.用于检测和/或预后头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的方法,所述方法包括以下步骤:(i)从个体获得分离的生物样品;(ii)从所述样品纯化基因组DNA;(iii)用亚硫酸氢盐,优选地亚硫酸氢钠,处理所述基因组DNA;(iv)在步骤(iii)之后,通过使用至少一个引物对来扩增所述基因组DNA,所述引物对允许扩增选自以下的至少一个基因的基因组DNA区域的至少一个序列:EPHX3、KIF1A、LRRTM1、FLI1、ITGA4、LINC00599、NTM、PARP15、ZAP70、miR193、miR296、GP1BB、hTERT及其任何组合,所述序列包含至少一个CpG和/或CpG岛;(v)测量落入根据步骤(iv)扩增的并且属于以下基因集的序列中的至少一个CpG和/或CpG岛的甲基化水平:a)人类TERT和KIF1A;和/或b)LRRTM1、PARP15、ZAP70、miR193、miR296、hTERT;和/或c)KIF1A、LRRTM1、ZAP70、miR193、miR296、hTERT;和/或d)KIF1A、LRRTM1、FLI1、LINC00599、PARP15、ZAP70、miR193、miR296、GP1BB、hTERT;和/或e)EPHX3、KIF1A、LRRTM1、FLI1、ITGA4、LINC00599、NTM、PARP15、ZAP70、miR193、miR296、GP1BB、hTERT,其中落入所述集的以下基因:EPHX3、KIF1A、LRRTM1、FLI1、ITGA4、LINC00599、NTM、PARP15、ZAP70、miR193中的至少一个的序列中的所述至少一个CpG和/或CpG岛的超甲基化和/或落入所述集的以下基因:miR296、GP1BB、hTERT中的至少一个的序列中的所述至少一个CpG和/或CpG岛的低甲基化指示HNSCC阳性样品,其中所述超甲基化和/或所述低甲基化是与从健康个体分离的样品中测量的甲基化水平相比来评估的。2.根据权利要求1所述的方法,其中所述HNSCC是在口、鼻和喉中发展的任何肿瘤,优选地所述HNSCC为口腔鳞状细胞癌(OSCC)、或OSCC的前体,优选地高度鳞状上皮内病变(HG-SIL)、或口腔癌前病变(OPML)、或癌变场,其中所述OPML优选地选自:黏膜白斑病、黏膜红斑病、反吸烟性腭部病变、口腔扁平苔藓、口腔黏膜下纤维化(SMF)和盘状红斑狼疮。3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述生物样品选自:来自口腔黏膜的刷或DNA口腔拭子、血浆、唾液或包含上皮细胞的任何样品,优选地来自口腔。4.根据权利要求1-3中任一项的所述方法,其中经历步骤(iii)的基因组DNA的量范围为从50ng至10μg,优选地从250ng至1μg。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中亚硫酸氢盐处理包括DNA变性步骤和使所述变性的DNA与范围为从2.3M至3.6M的量的亚硫酸氢盐在范围为从45℃至60℃,优选地从50℃至55℃的温度反应至少一小时的步骤。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述基因组DNA区域选自:基因的调节区域,优选地基因启动子、5'UTR、3'UTR、和编码区域,优选地外显子和/或内含子和/或岸。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中扩增步骤(iv)包括1)扩增所述基因组DNA区域的所述至少一个序列的第一模板特异性扩增步骤;和2)用于条形码化模板特异性扩增产物和样品识别的第二扩增步骤。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述模板特异性扩增步骤使用多重策略来进行。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述模板特异性扩增步骤使用至少一个融合引物对进行,所述融合引物对包括正向引物和反向引物用于扩增感兴趣的所述基因组DNA区域,其中所述对的每个引物是融合引物,所述融合引物包括与所述基因组区域的所述至少一个序列的至少一部分杂交的模板特异性部分和为通用序列的第二部分。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中所述第二扩增步骤包括使用至少一个融合引物对,所述融合引物对包括正向引物和反向引物,其中所述对的每个引物从所述引物序列的5’末端开始包括:1)对所使用的测序平台特异性的衔接子序列,优选地所述测序平台为Illumina和/或IonTorrent;2)样品特异性条形码序列,优选地多重标识符(MID)或索引;和3)与在所述第一扩增步骤中使用的所述引物对的通用序列互补的通用接头标签。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法,其中步骤(iv)的所述至少一个引物对或权利要求9所述的融合引物对选自:-SEQIDNO:1和2和/或SEQIDNO:27和28,用于分别优选地用IonTorrent和Illumina平台扩增PARP15;和/或-SEQIDNO:3和4和/或SEQIDNO:29和30,用于分别优选地用IonTorrent和Illumina平台扩增ITGA4;和/或-SEQIDNO:5和6和/或SEQIDNO:31和32,用于分别优选地用IonTorrent和Illumina平台扩增NMT;和/或-SEQIDNO:7和8和/或SEQIDNO:33和34,用于分别优选地用IonTorrent和Illumina平台扩增ZAP70;和/或-SEQIDNO:9和10和/或SEQIDNO:35和36,用于分别优选地用IonTorrent和Illumina平台扩增MIR193A;和/或-SEQIDNO:11和12和/或SEQIDNO:37和38,用于分别优选地用IonTorrent和Illumina平台扩增EPKH3;和/或-SEQIDNO:13和14和/或SEQIDNO:39和40,用于分别优选地用IonTorrent和Illumina平台扩增KIF1A;和/或-SEQIDNO:15和16和/或SEQIDNO:41和42,用于分别优选地用IonTorrent和Illumina平台扩增LINC00599;和/或-SEQIDNO:17和18和/或SEQIDNO:43和44,用于分别优选地用IonTorrent和Illumina平台扩增FLI1;和/或-SEQIDNO:19和20和/或SEQIDNO:45和46,用于分别优选地用IonTorrent和Illumina平台扩增GP1BB;和/或-SEQIDNO:21和22和/或SEQIDNO:47和48,用于分别优选地用IonTorrent和Illumina平台扩增MIR296;和/或-SEQIDNO:23和24和/或SEQIDNO:49和50,用于分别优选地用IonTorrent和Illumina平台扩增LRRTM1;和/或-SEQIDNO:25和26和/或SEQIDNO:51和52,用于分别优选地用IonTorrent和Illumina平台扩增人类TERT。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述基因组DNA区域的所述至少一个序列选自SEQIDNO:53-65,其中:-SEQIDNO:53是根据hg19坐标跨越染色体3链+的122296564至122296725的PARP15外显子1的区域;和/或-SEQIDNO:54是根据hg19坐标跨越染色体2链+的182322887至182323053的ITGA4外显子2的区域;和/或-SEQIDNO:55是根据hg19坐标跨越染色体11链+的131781042至131781185的NTM外显子1的区域;和/或-SEQIDNO:56是根据hg19坐标跨越染色体12链+的98340750至98340885的ZAP70外显子3的区域;和/或-SEQIDNO:57是根据hg19坐标跨越染色体17链+的29886860至29887068的MIR193A外显子1的区域;和/或-SEQIDNO:58是根据hg19坐标跨越染色体19链-的15342826至15343049的EPHX3外显子1的区域;和/或-SEQIDNO:59是根据hg19坐标跨越染色体2链-的241759586至241759727的KIF1A外显子1的区域;和/或-SEQIDNO:60是根据hg19坐标跨越染色体8链-的9760739至9760890的LINC00599外显子1的区域;和/或-SEQIDNO:61是根据hg19坐标跨越染色体11链+的128564020至128564160的FLI1外显子1的区域;和/或-SEQIDNO:62是根据hg19坐标跨越染色体22链+的19710829至19710960的GP1BB外显子1的区域;和/或-SEQIDNO:63是根据hg19坐标跨越染色体20链-的57392355至57392545的MIR296外显子1的区域;和/或-SEQIDNO:64是根据hg19坐标跨越染色体2链-的80531676至80531807的LRRTM1启动子的区域;和/或-SEQIDNO:65是根据hg19坐标跨越染色体21链-的1279743至1279851的人类TERT(hTERT)启动子的区域。13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法,其中所述至少一个CpG/CpG岛选自:-落入PARP15外显子1SEQIDNO:53的基因组区域的CpG/CpG岛,根据hg19坐标具有染色体3链+的122296564至122296725的坐标,优选地选自以下的至少一个坐标:122296564、122296586、122296613、122296617、122296623、122296630、122296637、122296645、122296649、122296656、122296663、12229665、122296671、122296677、122296680、122296692、122296708、122296710、122296717、122296723及其组合,更优选地所述CpG/CpG岛坐标为122296586;和/或-落入ITGA4外显子2SE...
【专利技术属性】
技术研发人员:卢卡·莫兰迪,达维德·巴尔托洛梅奥·吉西,阿希尔·塔西塔诺,
申请(专利权)人:大学之母博洛尼亚大学,
类型:发明
国别省市:意大利,IT
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