多重信号放大制造技术

在一些实施方案中，本文提供了用于通过发夹介导的多连体化进行高度地多重原位信号放大的方法和组合物。

Multiple signal amplification

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多重信号放大相关申请本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2017年1月10日提交的美国临时申请号62/444,734、于2017年8月16日提交的美国临时申请号62/546,418和于2017年8月17日提交的美国临时申请号62/546,836的权益，上述每一个申请的全部内容通过引用并入本文。联邦资助的研究本专利技术在由美国国防部海军研究办公室颁发的N00014-13-1-0593、N00014-16-1-2182和N00014-16-1-2410的政府支持下做出。政府在本专利技术中具有一定的权利。
技术介绍
对生物分子的亚细胞定位模式的理解可以对这些分子如何发挥作用提供关键的启示。因此，探寻生物分子的原位定位的技术诸如荧光原位杂交(FISH)和免疫荧光(IF)在从基础研究到临床诊断的广泛学科范围中具有关键的作用。尽管这些方法被广泛使用，但它们由于荧光团的广谱重叠而具有有限的复用能力。此外，当靶标的丰度低或在拥挤的组织环境条件下被检验时，利用这些技术经常难以获得对于产生清晰的可判读信号可接受的原位信噪比。
技术实现思路
在一些实施方案中提供了与用于例如在组织样品和在体液样品中的原位分子(例如，核酸和/或蛋白)检测的高水平复用相容的稳健的高效的成像方法。原位检测的重要标准是对可变表达水平的靶标的可实现水平的信号。尤其是对于厚的组织样品，对稀少靶标的检测由于高的自发荧光背景和增加的信号散射而一直是具有挑战性的。对于几种靶标的多重免疫荧光检测，这个问题更严重，所述多重免疫荧光检测需要放弃二抗，并且因此它们通过多价结合提供的放大作用有限。这就形成了对信号放大的明显需求，特别是对低丰度靶标成像。本公开的多重平台提供了用于多个低丰度靶标的原位信号放大的手段，同时避免了诸如高自发荧光背景和增加的信号散射的障碍，所述障碍伴随对厚组织样品内的分子成像而发生。本公开的方法和组合物能够在各种各样的不同情况下实现多重分析，包括，但不限于，例如在健康的和阿尔茨海默病的人脑切片中神经元免疫因子(例如，细胞因子)以及它们与神经元细胞的相互作用。直接在原位以及在蛋白水平进行的此类分析对于理解例如小神经胶质细胞对不同的神经元细胞类型的神经毒性作用和神经保护作用以及它们在全身水平上与神经退行性疾病的相关性是有价值的。在不同的组织类型中其他多重分析也在理解各种各样的其他疾病状态方面提供了极大的益处，因为许多严重的疾病涉及多种因素，这些多种因素应当同时研究。如本文所提供的多重信号放大方法从短的ssDNA引物序列生成长的ssDNA多连体。这些多连体然后用作骨架链，荧光链被应用于所述骨架链上以生成局部的、放大的可检测信号。这些方法为原位标记提供了如下的独特的优势，例如：它们典型地使用简单的和廉价的试剂，并且与细胞和组织中的原位扩增相容，提供高信噪比(SNR)；终产物在空间上是紧凑的，使得能够以更好的成像质量和分辨率更好地空间分离多个靶标(相对于现有方法)；并且所述方法保证了对序列设计的极大灵活性，使得其可用于设计和实施同时的多重能力。因此，本公开的一些方面提供了多重靶标检测方法，包括：(a)将含有多种分子(例如，核酸靶标)的样品与多种探针链(例如，浓度为1nM-1μM)混合，其中每种探针链包含：(i)与所述分子靶标的一个区域互补(例如，与所述核酸靶标之一互补的)的未配对5′靶结构域和(ii)未配对3′引物结构域，以及产生包含与探针链结合的分子靶标的第一反应混合物；(b)将在步骤(a)中产生的所述第一反应混合物与dNTP(例如，浓度为1-500μM)、链置换聚合酶和多种催化分子(例如，浓度为1nM-μM)混合，其中每种催化分子从5′到3′包含第一结构域、第二结构域和第三结构域，其中所述第一结构域与所述第二结构域结合，且所述第三结构域是与所述探针链之一的所述未配对3′引物结构域互补的未配对3′立足点结构域，以及产生包含与分子靶标结合的核酸多连体的第二反应混合物；(c)将在步骤(b)中产生的所述第二反应混合物与多种信号链(例如，浓度为1nM-1μM)混合，其中每种信号链与不同的可检测分子连接并且包含与所述探针链之一的所述未配对3′引物结构域互补的结构域，以及产生被多种信号链标记的多连体；以及(d)任选地进一步包括使所述标记的多连体成像。本公开的其他方面提供了多重靶标检测方法，包括：(a)将多种探针链与dNTP、链置换聚合酶和多种催化分子混合,其中每种探针链包含：(i)与分子(例如，核酸)靶标互补的未配对5′靶结构域和(ii)未配对3′引物结构域，并且其中每种催化分子从5′到3′包含第一结构域、第二结构域和第三结构域，其中所述第一结构域与所述第二结构域结合，并且第三结构域是与所述探针链之一的所述未配对3′引物结构域互补的未配对3′立足点结构域，以及产生包含与探针链结合的核酸多连体的第一反应混合物；(b)将在步骤(a)中产生的所述第一反应混合物与含有多种分子靶标(例如，核酸靶标)的样品混合，并产生包含与分子靶标结合的核酸多连体的第二反应混合物；(c)将在步骤(b)中产生的所述第二反应混合物与多种信号链混合，其中每种信号链与不同的可检测分子连接并包含与所述探针链之一的所述未配对3′引物结构域互补的结构域，以及产生被多种信号链标记的多连体；以及(d)任选地进一步包括使所述标记的多连体成像。在一些实施方案中，催化分子包含DNA。在一些实施方案中，催化分子包含RNA。在一些实施方案中，每种催化分子的第一结构域与同一催化分子的第二结构域结合。在一些实施方案中，每种催化分子的第一结构域包含与同一催化分子的第二结构域完全互补的序列。在一些实施方案中，每种催化分子的第二结构域包含与同一催化分子的第三结构域相同的序列。在一些实施方案中，每种催化分子进一步包含使位于同一催化分子的第一结构域和第二结构域之间的聚合作用终止的封基分子或修饰。例如，使聚合作用终止的分子或修饰可以选自三乙二醇(TEG)、18-原子六-乙二醇、腺苷酸化、叠氮化物、洋地黄毒苷、胆固醇基-TEG、3-氰基乙烯基咔唑(CNVK)、异-dG和异-dC。在一些实施方案中，封基分子是鸟嘌呤，且催化分子包含腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶，或在其他实施方案中，封基分子是胞嘧啶，且催化分子包含腺嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘌呤。在一些实施方案中，每种催化分子是催化性发夹分子，所述催化性发夹分子进一步包括进一步包含位于第一结构域和第二结构域之间的环结构域。在一些实施方案中，每种催化性发夹分子包含长度为25-300个核苷酸的单链DNA。在一些实施方案中，催化分子包含结合在一起的两条DNA链，由此第一链包含第一结构域，第二链包含第二结构域和第三结构域。在一些实施方案中，探针链包含DNA。在一些实施方案中，探针链包含RNA。在一些实施方案中，每种探针链的长度为10-50个核苷酸。在一些实施方案中，每种探针链的靶结构域的长度为5-25个核苷酸。在一些实施方案中，每种探针链的引物结构域的长度为5-25个核苷酸。在一些实施方案中，核酸靶标包括DNA或RNA。例如，核酸靶标可以是染色体DNA，或核酸靶标可以是mRNA或miRNA。在一些实施方案中，信号链的可检测分子是荧光团。在一些实施方案中，每种信号链的长度为10-30个核苷酸。在一些实施方案本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多重靶标检测方法,其包括：(a)将含有多种核酸靶标的样品与多种探针链混合，每种探针链包含：(i)与所述核酸靶标之一互补的未配对5′靶结构域和(ii)未配对3′引物结构域，以及产生包含与探针链结合的分子靶标的第一反应混合物；(b)将在步骤(a)中产生的所述第一反应混合物与dNTP、链置换聚合酶和多种催化分子混合，每种催化分子从5′到3′包含第一结构域、第二结构域和第三结构域，其中所述第一结构域与所述第二结构域结合，且所述第三结构域是与所述探针链之一的未配对3′引物结构域互补的未配对3′立足点结构域，以及产生包含与分子靶标结合的核酸多连体的第二反应混合物；(c)将在步骤(b)中产生的所述第二反应混合物与多种信号链混合，每种信号链与不同的可检测分子连接并且包含与所述探针链之一的所述未配对3′引物结构域互补的结构域，以及产生被多种信号链标记的多连体；以及(d)任选地进一步包括使所述标记的多连体成像。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.01.10 US 62/444,734;2017.08.16 US 62/546,418;1.一种多重靶标检测方法,其包括：(a)将含有多种核酸靶标的样品与多种探针链混合，每种探针链包含：(i)与所述核酸靶标之一互补的未配对5′靶结构域和(ii)未配对3′引物结构域，以及产生包含与探针链结合的分子靶标的第一反应混合物；(b)将在步骤(a)中产生的所述第一反应混合物与dNTP、链置换聚合酶和多种催化分子混合，每种催化分子从5′到3′包含第一结构域、第二结构域和第三结构域，其中所述第一结构域与所述第二结构域结合，且所述第三结构域是与所述探针链之一的未配对3′引物结构域互补的未配对3′立足点结构域，以及产生包含与分子靶标结合的核酸多连体的第二反应混合物；(c)将在步骤(b)中产生的所述第二反应混合物与多种信号链混合，每种信号链与不同的可检测分子连接并且包含与所述探针链之一的所述未配对3′引物结构域互补的结构域，以及产生被多种信号链标记的多连体；以及(d)任选地进一步包括使所述标记的多连体成像。2.一种多重靶标检测方法,其包括：(a)将多种探针链与dNTP、链置换聚合酶和多种催化分子混合,其中每种探针链包含：(i)与多种核酸靶标中的核酸靶标互补的未配对5′靶结构域和(ii)未配对3′引物结构域，并且其中每种催化分子从5′到3′包含第一结构域、第二结构域和第三结构域，其中所述第一结构域与所述第二结构域结合，并且第三结构域是与所述探针链之一的所述未配对3′引物结构域互补的未配对3′立足点结构域，以及产生包含与探针链结合的核酸多连体的第一反应混合物；(b)将在步骤(a)中产生的所述第一反应混合物与含有所述多种核酸靶标的样品混合，并产生包含与分子靶标结合的核酸多连体的第二反应混合物；(c)将在步骤(b)中产生的所述第二反应混合物与多种信号链混合，其中每种信号链与不同的可检测分子连接并包含与所述探针链之一的所述未配对3′引物结构域互补的结构域，以及产生被多种信号链标记的多连体；以及(d)任选地进一步包括使所述标记的多连体成像。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述催化分子包含DNA和/或RNA。4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中每种催化分子的所述第一结构域与同一催化分子的所述第二结构域结合，其中每种催化分子的所述第二结构域包含与同一催化分子的所述第三结构域相同的序列，和/或其中每种催化分子的所述第一结构域包含与同一催化分子的所述第二结构域完全互补的序列。5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中每种催化分子进一步包含使位于同一催化分子的所述第一结构域和所述第二结构域之间的聚合作用终止的封基分子或修饰。6.权利要求5所述的方法，其中使聚合作用终止的所述封基分子或修饰选自三乙二醇(TEG)、18-原子六-乙二醇、腺苷酸化、叠氮化物、洋地黄毒苷、胆固醇基-TEG、3-氰基乙烯基咔唑(CNVK)、异-dG和异-dC，其中所述封基分子是鸟嘌呤，且所述催化分子包含腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶，或其中所述封基分子是胞嘧啶，且所述催化分子包含腺嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘌呤。7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中每种催化分子是催化性发夹分子，所述催化性发夹分子进一步包含位于所述第一结构域和所述第二结构域之间的环结构域。8.权利要求7所述的方法，其中每种催化性发夹分子包括长度为25-300个核苷酸的单链DNA。9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述探针链包含DNA和/或RNA。10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中每种探针链的长度为10-50个核苷酸，每种探针链的靶结构域长度为5-25个核苷酸，和/或每种探针链的引物结构域的长度为5-25个核苷酸。11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述核酸靶标包括DNA和/或RNA。12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述核酸靶标是染色体DNA、mRNA或miRNA。13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述信号链的可检测分子是荧光团。14.权利要求1-13中任一项所述的方法，其中每种信号链的长度为10-30个核苷酸。15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述链置换聚合酶选自phi29DNA聚合酶、BstDNA聚合酶和BsuDNA聚合酶大片段。16.权利要求1-15中任一项所述的方法，其中:所述多种探针链包括2-10,000种所述探针链；所述多种催化分子包括2-10,000种所述催化分子；以及所述多种信号链包括2-10,000种所述信号链。17.权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述样品是细胞样品或组织样品。18.一种多重靶标检测方法，其包括：(a)将含有多种蛋白或肽靶标的样品与多种初级结合伴侣混合，每种所述初级结合伴侣特异性地结合蛋白或肽靶标并连接到探针链，以及产生包含与初级结合伴侣结合的蛋白或肽的第一反应混合物；(b)将步骤(a)中产生的所述第一反应混合物与dNTP、链置换聚合酶和多种催化分子混合，每种催化分子从5′到3′包含第一结构域、第二结构域和第三结构域，其中所述第一结构域与所述第二结构域结合，且所述第三结构域是与所述初级结合伴侣之一的探针链互补的未配对3′立足点结构域，以及产生包含与初级结合伴侣结合的核酸多连体的第二反应混合物；(c)将步骤(b)中产生的所述第二反应混合物与多种信号链混合，每种信号链连接到不同的可检测分子并包含与所述初级结合伴侣之一的桥链互补的结构域，以及产生被多种信号链标记的多连体；以及(d)任选地进一步包括使所述标记的多连体成像。19.一种多重靶标检测方法，其包括：(a)将含有多种蛋白或肽靶标的样品与多种初级结合伴侣混合，每种所述初级结合伴侣特异性地结合蛋白或肽靶标并连接到桥链，以及产生包含与初级结合伴侣结合的蛋白或肽的第一反应混合物；(b)将所述第一反应混合物与通过在第二反应混合物中混合dNTP、链置换聚合酶、多种探针链和多种催化分子而产生的与探针链结合的多连体混合，其中每种探针链包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·Y·基希，B·贝利沃，尹鹏，王瑜，S·K·萨卡，
申请(专利权)人：哈佛学院院长及董事，
类型：发明
国别省市：美国,US