用于使用工程化酵母菌株从含有木糖的纤维素基质生产乙醇的改善方法技术

本文提供了具有编码己糖转运体的异源多核苷酸、和编码木糖异构酶的异源多核苷酸的重组宿主细胞，其中所述细胞能够在葡萄糖存在下和在氧限制的生长下发酵木糖。还描述了使用所述重组细胞发酵糖化材料来以更高产率生产乙醇的方法。

An improved method for ethanol production from xylose-containing cellulose matrix using engineered yeast strains

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于使用工程化酵母菌株从含有木糖的纤维素基质生产乙醇的改善方法序列表的引用本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
技术介绍
乙醇是通常共混入汽油中的运输燃料。纤维素材料用作乙醇生产方法中的原料。在本领域中存在若干种用于制造含有葡萄糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖的纤维素和半纤维素水解产物的方法。葡萄糖和甘露糖在天然无氧代谢过程中有效地转化为乙醇。然而，为了以工业规模获得经济上相关的方法，水解产物中的木糖必须发酵成乙醇。已经报道了建立和改善酵母(酿酒酵母)的戊糖(例如，木糖)利用方面的努力(Kim等人,2013,BiotechnolAdv.[生物技术进展]31(6):851-61)。这些包括来自天然发酵木糖的酵母如树干毕赤酵母(Scheffersomyces(Pichia)stipitis)和各种假丝酵母属(Candida)菌种的木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)的异源表达，以及木酮糖激酶(XK)和非氧化性戊糖磷酸途径(PPP)中的四种酶，即转酮酶(TKL)、转醛酶(TAL)、核糖-5-磷酸酮醇异构酶(RKI)和D-核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶(RPE)的过表达。已经发现在此类系统中修饰树干毕赤酵母XR对NADH的辅因子偏好提供代谢优势以及改善厌氧生长。还已经报道了用异源木糖异构酶(XI)替换XR/XDH的途径。这些和其他修饰已描述于，例如WO2003/062430、WO2009/017441、WO2010/059095、WO2012/113120、和WO2012/135110中。尽管在过去十年中对从纤维素材料的乙醇生产方法进行了改善，但是跨酵母膜摄取戊糖(例如木糖)仍然是一个挑战。在一种办法中，具有木糖还原酶(XR)/木糖醇脱氢酶(XDH)途径的酿酒酵母宿主细胞经过工程化以过表达各种己糖转运体(HXT1、HXT2、HXT5和HXT7)，但显示在葡萄糖和木糖的共发酵过程中较差的木糖消耗(<60％)(Goncalves等人,2014,EnzymeMicrob.Technol.[酶与微生物技术],63:13-20)。该研究报道，过表达HXT2的菌株产生不完全的厌氧发酵，其中乙醇比率与表达任何其他转运体(HXT1、HXT5或HXT7)的菌株相比显著降低。因此，仍然需要可以用于使用含有木糖的纤维素植物废物基质来改善乙醇生产的新工业方法，例如在氧限制条件下同时利用戊糖(例如木糖)和葡萄糖的发酵方法。
技术实现思路
本文描述了包含编码己糖转运体(例如HXT2)的异源多核苷酸的重组宿主细胞，其中所述细胞能够发酵戊糖(例如木糖)。在一个方面，所述重组细胞进一步包含编码木糖异构酶的异源多核苷酸。在一些实施例中，所述己糖转运体与SEQIDNO:2具有至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述己糖转运体具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或由SEQIDNO:2的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述木糖异构酶与SEQIDNO:18具有至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，所述木糖异构酶具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列包含SEQIDNO:18的氨基酸序列或由SEQIDNO:18的氨基酸序列组成。在一些实施例中，与没有编码己糖转运体的异源多核苷酸的相同细胞相比，在孵育约4天或孵育4天后(例如在实例2中描述的条件下)，重组细胞能在戊糖(例如木糖)上有更高的厌氧生长速率。在一些实施例中，与没有编码己糖转运体的异源多核苷酸的相同细胞相比，在发酵约40小时或发酵40小时后(例如在实例3中描述的条件下)，重组细胞能有更高的戊糖(例如木糖)消耗。在一些实施例中，在发酵约66小时或发酵66小时之后(例如在实例4中描述的条件下)，重组细胞能够消耗培养基中超过65％，例如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的戊糖(例如木糖)，和/或能够消耗培养基中超过65％，例如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的葡萄糖。在一些实施例中，与没有编码己糖转运体的异源多核苷酸的相同细胞相比，在发酵约40小时或发酵40小时后(例如在实例3中描述的条件下)，重组细胞能有更高的乙醇生产。在一些实施例中，所述重组细胞进一步包含编码木酮糖激酶(XK)，例如与SEQIDNO:22具有至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的XK的异源多核苷酸。在一些实施例中，所述重组细胞进一步包含编码选自以下的多肽的异源多核苷酸：核酮糖5磷酸3-差向异构酶(RPE1)、核酮糖5磷酸异构酶(RKI1)、转酮酶(TKL1)、转醛酶(TAL1)。在一些实施例中，重组细胞包含对编码GPD和/或GPP的一种或多种内源基因的破坏。在一些实施例中，重组细胞选自酵母属(Saccharomyces)、红酵母属(Rhodotorula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、假丝酵母属(Candida)、耶氏酵母属(Yarrowia)、油脂酵母属(Lipomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)或德克拉酵母属(Dekkera)菌种细胞。在一些实施例中，重组细胞是酿酒酵母细胞，例如菌株酿酒酵母CIBTS1260(在美国伊利诺伊州(Illinois)61604农业研究服务菌种保藏中心(NRRL)登录号NRRLY-50973下保藏)的衍生物。还描述了使用重组细胞生产乙醇的方法。一个方面是用于生产乙醇的方法，该方法包括在适合的条件下，在可发酵培养基中培养本文描述的重组细胞以生产乙醇。在另一方面，是用于生产乙醇的方法，该方法包括：(a)用酶组合物糖化含纤维素材料和/或含淀粉材料；和(b)用本文描述的重组细胞发酵步骤(a)的经糖化的材料。在所述方法的一些实施例中，在相同条件(例如在发酵约40小时或发酵40小时后，如实例3中描述的条件)下，当与使用没有该编码己糖转运体的异源多核苷酸的相同细胞的发酵相比时，发酵消耗了增加量的葡萄糖和戊糖(例如木糖)。在一个实施例中，在发酵约66小时或发酵66小时之后(例如在实例4中描述的条件下)，培养基中超过65％，例如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的戊糖(例如木糖)被消耗，和/或培养基中超过65％，例如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的葡萄糖被消耗。在所述方法的一些实施例中，在相同条件(例如在发酵约40小时或发酵40小时后，如实例3中描述的条件)下，当与使用没有该编码己糖转运体的异源多核苷酸的相同细胞的发酵相比时，发酵提供更高的乙醇产率。在所述方法的一些实施例中，发酵在厌氧条件下进行。在所述方法的一些实施例中，进一步包括从发酵回收发酵产物。在所述方法的一些实施例中，糖化发生在纤维素材料上，且该纤维素材料是经预处理的。在一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组酵母细胞，该重组酵母细胞包含编码己糖转运体的异源多核苷酸和编码木糖异构酶的异源多核苷酸，其中所述己糖转运体与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性；并且其中所述酵母细胞能够发酵木糖。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.06 US 62/430,6901.一种重组酵母细胞，该重组酵母细胞包含编码己糖转运体的异源多核苷酸和编码木糖异构酶的异源多核苷酸，其中所述己糖转运体与SEQIDNO:2具有至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性；并且其中所述酵母细胞能够发酵木糖。2.如权利要求1所述的重组细胞，其中所述异源多核苷酸编码与SEQIDNO:2相差不超过十个氨基酸，例如相差不超过五个氨基酸、相差不超过四个氨基酸、相差不超过三个氨基酸、相差不超过两个氨基酸、或相差一个氨基酸的己糖转运体。3.如权利要求1所述的重组细胞，其中所述异源多核苷酸编码具有以下氨基酸序列的己糖转运体，该氨基酸序列包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或由SEQIDNO:2的氨基酸序列组成。4.如权利要求1-3中任一项所述的重组细胞，其中所述编码己糖转运体的异源多核苷酸包含与SEQIDNO:1具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的编码序列。5.如权利要求4所述的重组细胞，其中所述编码己糖转运体的异源多核苷酸具有由SEQIDNO:1组成的编码序列。6.如权利要求1-5中任一项所述的重组细胞，其中所述编码己糖转运体的异源多核苷酸包含以下编码序列，该编码序列在至少低严格条件下，例如中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与SEQIDNO:1的全长互补链杂交。7.如权利要求1-6中任一项所述的重组细胞，其中与没有所述编码己糖转运体的异源多核苷酸的相同细胞相比，在孵育约4天或孵育4天后(例如在实例2中描述的条件下)，菌株在戊糖(例如木糖)上具有更高的厌氧生长速率。8.如权利要求1-7中任一项所述的重组细胞，其中与没有所述编码己糖转运体的异源多核苷酸的相同细胞相比，在发酵约40小时或发酵40小时后(例如在实例3中描述的条件下)，菌株具有更高的戊糖(例如木糖)消耗。9.如权利要求1-8中任一项所述的重组细胞，其中与没有所述编码己糖转运体的异源多核苷酸的相同细胞相比，在发酵约40小时或发酵40小时后(例如在实例3中描述的条件下)，菌株具有更高的乙醇生产。10.如权利要求1-9中任一项所述的重组细胞，该重组细...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·约舒姆森，JM·缪伦，J·阿尔瑙，M·塔索内，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK