抑制CD73表达的免疫抑制恢复寡核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及包含12至18个核苷酸的免疫抑制恢复寡核苷酸，其中至少一个核苷酸被修饰，并且该寡核苷酸与SEQ ID NO.1(人)的胞外酶(CD73)的核酸序列和/或SEQ ID NO.2(鼠)的序列的胞外酶(CD73)的核酸序列杂交，其中该寡核苷酸抑制至少50％的CD73表达。本发明专利技术还涉及包含这种寡核苷酸的药物组合物。

Immunosuppressive recovery of oligonucleotides by suppressing CD73 expression

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抑制CD73表达的免疫抑制恢复寡核苷酸
本公开涉及与胞外酶(NT5E或CD73)的核酸序列杂交的免疫抑制恢复寡核苷酸，以及包含这种免疫抑制恢复寡核苷酸和药用载体、赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。
技术介绍
近年来，通过应用免疫疗法，特别是通过所谓的“免疫检查点”的抑制剂，对如恶性肿瘤的几种不同疾病的治疗非常成功。这些检查点是免疫系统中的分子，其上调(共刺激分子)或下调信号。治疗方法的概念基于内源性抗肿瘤免疫反应的激活。例如，许多癌症分别通过抑制T细胞和NK细胞活性来保护自己免受免疫系统的侵害。免疫检查点调节剂，即刺激剂或抑制剂，例如针对CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、VISTA、A2AR、BTLA、IDO、CD39、CD73、STAT3、TDO2、TIM-3、MICA、NKG2A、KIR、TIGIT、TGF-β、Ox40、GITR、CD27、CD160、2B4和4-1Bb中的一种或多种。CD73需要被认为是提高对不同类型癌症的免疫力的一种新颖且有前景的候选物。CD73是一种胞外酶(NTPdase)，并且催化AMP向免疫抑制性腺苷的转化。CD73协同作用，但在CD39的下游，已知将ATP转化为ADP，并将ADP转化为AMP。腺苷通过腺苷受体A1、腺苷受体A2A、腺苷受体A2B和腺苷受体A3发挥其作用。表达腺苷受体并因此可能受腺苷的免疫调节作用影响的免疫细胞的范围包括T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、巨噬细胞、DC、中性粒细胞、肥大细胞和B细胞。CD73存在于大多数组织和许多细胞类型中，包括淋巴细胞的亚群、巨噬细胞、树突细胞、内皮细胞和上皮细胞。缺氧诱导小鼠微血管内皮细胞中的CD73mRNA、蛋白质表达并增加CD73活性。特别地，CD73在许多不同的人(实体和血液)肿瘤中高度表达，并且其升高的表达和活性与肿瘤侵袭性和转移相关并且具有较短的患者存活期。CD73的RNA表达和酶活性在不同的乳腺癌细胞系中是可变的。将死的癌细胞将ATP释放到肿瘤微环境中的细胞外空间。活的肿瘤细胞通常表达高水平的CD39和CD73，并将ATP转化为免疫抑制性腺苷。由此，肿瘤细胞能够进行不受控制的增殖和扩增。通过与淋巴细胞上的A2A或A2B受体结合，腺苷介导对这些细胞的免疫抑制信号。例如，T细胞的增殖、细胞毒性细胞因子产生和激活受到抑制。NK细胞显示出降低的细胞毒性潜力。腺苷诱导巨噬细胞中的替代激活(免疫抑制性M2表型)，导致促炎性细胞因子产生减少，但免疫抑制性细胞因子IL-10的产生增加。CD73作为相关治疗靶标在不同肿瘤中的重要作用由以下事实强调：使用CD73或A2A受体敲除小鼠的肿瘤模型显示出改善的疾病结果。抗人CD73单克隆抗体如InnatePharma的抗CD73抗体(例如，InnatePharmaPoster#iph_poster_aarc2016_cd73)目前正在基于免疫肿瘤学细胞的试验中进行临床前研究。然而，由于空间位阻，针对CD73的单克隆抗体可能无法定位于肿瘤微环境中。此外，CD73的不可水解的小分子抑制剂如AMPCP(腺苷5'-(α,β-亚甲基)二磷酸；例如，结构20,2161-2173,2012年12月5日)(其为ADP类似物)竞争性地抑制CD73活性，已经在动物模型中体外和体内测试，但需要相对高的浓度和重复给药以成功阻断CD73酶活性。免疫疗法已经导致长期缓解，但到目前为止只对小患者群体。原因可能是许多免疫检查点和可选的其它免疫抑制机制参与例如免疫系统和肿瘤细胞之间的相互作用。免疫检查点和潜在的其它机制的组合可以根据肿瘤和受试者的个体状况而不同，以逃避身体的防御。为了抑制几种免疫抑制机制，使用抗体和/或小分子的常用方法不适合或几乎不适合，因为分子靶标位于细胞内或不具有酶活性。因此，安全有效地抑制如CD73的“免疫检查点”功能的药剂将是治疗患有例如由该酶活性影响的疾病或病症的患者的重要补充。本专利技术的寡核苷酸分别在抑制CD73的表达和活性方面非常成功。寡核苷酸的作用方式不同于抗体或小分子的作用方式，并且寡核苷酸对于例如以下是非常有利的(i)肿瘤组织在实体肿瘤中的渗透，(ii)分别阻断靶标的多项功能和活动，(iii)寡核苷酸彼此或与抗体或小分子的组合，和(iv)抑制对于抗体是不可接近的或通过小分子可抑制的细胞内效果。因此，通过反义寡核苷酸在mRNA水平上靶向癌症和免疫细胞上的CD73表达是开发和改进例如分别针对不同癌症和免疫疾病的免疫疗法的有前景的最新技术方法。
技术实现思路
本专利技术涉及寡核苷酸，如包含约10至20个核苷酸的免疫抑制恢复(immunosuppression-reverting)寡核苷酸，其中至少一个核苷酸被修饰。寡核苷酸与例如SEQIDNO.1(人)的胞外酶CD73的核酸序列和/或SEQIDNO.2(小鼠)的序列杂交。修饰的核苷酸例如选自由桥接核酸(例如，LNA、cET、ENA、2’氟修饰的核苷酸或2'O-甲基修饰的核苷酸)组成的组。在一些实施方式中，寡核苷酸抑制至少50％的CD73表达，并且在一些实施方式中，寡核苷酸以纳摩尔浓度抑制CD73的表达。与RNAi相比，反义寡核苷酸具有显着的优势。可以在体外转染反义寡核苷酸而不转染试剂，因此与使用专门转染RNAi的转染试剂的转染相比，该转染更接近体内条件。在不同组织中体内全身给予反义寡核苷酸是可能的，而体内给予RNAi依赖于递送系统，如GalNAc，例如在肝脏中。此外，反义寡核苷酸比RNAi短，因此在合成和吸收入细胞方面较不复杂。RNAi规律地显示同样可以启动RNAi的随从链的脱靶(off-target)效果。随从链RISC加载是RNAi药物的重要问题，因为随从链可能将RNAi活性导向非预期的靶标，导致毒副作用。“(参见Chackalamannil,Rotella,Ward,ComprehensiveModicinalChemistryIIIElsevier,03.06.2017)。反义寡核苷酸不包含随从链。本专利技术还涉及药物组合物，其包含本专利技术的免疫抑制恢复寡核苷酸和可选的药用载体、赋形剂和/或稀释剂。在一些实施方式中，该药物组合物另外包含化学治疗剂，如铂或吉西他滨，另一种寡核苷酸、抗体和/或例如在肿瘤治疗中有效的小分子。在一些实施方式中，本专利技术的寡核苷酸与另一种寡核苷酸、抗体和/或小分子组合，这些化合物中的每一种在药物组合物中分离或组合，其中寡核苷酸、抗体和/或小分子抑制或刺激免疫抑制因子，如IDO1、IDO2、CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、VISTA、A2AR,CD39、CD73、STAT3,TDO2、TIM-3、TIGIT、TGF-β、BTLA、MICA、NKG2A、KIR、CD160、Chop和/或Xbp1。另外或可替代地，寡核苷酸、抗体和/或小分子抑制或刺激免疫刺激因子，例如4-1BB、Ox40、KIR、GITR、CD27和/或2B4。此外，本专利技术涉及本专利技术的寡核苷酸或药物组合物在预防和/或治疗其中涉及CD73失衡的疾病的方法中的用途。在一些实施方式中，该病症是例如自身免疫病症，例如自身免疫性关节炎或胃肠道自身免疫疾病，例如炎性肠病(IBD)或结肠炎、免疫病症，例如由于慢性病毒感染如H本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含12至18个核苷酸的免疫抑制恢复寡核苷酸，其中，至少一个所述核苷酸被修饰，并且所述寡核苷酸与SEQ ID NO.1(人)的胞外酶(CD37)的核酸序列和/或SEQ ID NO.2(鼠)的序列的胞外酶(CD73)的核酸序列杂交，其中所述寡核苷酸抑制至少50％的CD73表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.07 EP 16192798.3;2017.08.24 EP 17187805.11.一种包含12至18个核苷酸的免疫抑制恢复寡核苷酸，其中，至少一个所述核苷酸被修饰，并且所述寡核苷酸与SEQIDNO.1(人)的胞外酶(CD37)的核酸序列和/或SEQIDNO.2(鼠)的序列的胞外酶(CD73)的核酸序列杂交，其中所述寡核苷酸抑制至少50％的CD73表达。2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中，修饰的所述核苷酸选自由桥接核酸如LNA，cET，ENA，2’氟修饰的核苷酸，2'O-甲基修饰的核苷酸和它们的组合组成的组。3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其与SEQIDNO.1和/或SEQIDNO.2的CD73杂交，包含选自由以下组成的组的序列：SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17、SEQIDNO.18、SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21、SEQIDNO.22、SEQIDNO.23、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28、SEQIDNO.29、SEQIDNO.30、SEQIDNO.31、SEQIDNO.32、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34、SEQIDNO.35、SEQIDNO.36、SEQIDNO.37、SEQIDNO.38、SEQIDNO.39、SEQIDNO.42、SEQIDNO.43、SEQIDNO.44、SEQIDNO.45、SEQIDNO.46、SEQIDNO.47和它们的组合。4.根据权利要求1至3中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸选自由以下组成的组+G*+A*+T*T*T*C*C*C*A*G*T*G*C*+C*+A*+T(A05018HM)、+G*+C*+T*G*T*G*C*A*C*G*T*C*+G*+T*+T(A05008HM)、+T*+G*+A*T*T*T*C*C*C*A*G*T*G*C*+C*+A*+T(A05028HM)、+G*+G*+C*T*G*T*G*C*A*C*G*T*C*+G*+T(A05009HM)、+C*+T*+C*A*G*A*A*T*T*G*G*A*A*+A*+T*+T(A05019HM)、+A*+C*+T*C*G*A*C*A*C*T*T*G*G*+T*+G*+C(A05026HM)、+C*+T*+G*T*G*C*A*C*G*T*C*+G*+T*+T(A05001HM)、+A*+G*C*A*C*G*T*T*G*G*G*T*+T*+C(A05002HM)、+A*+C*+G*G*T*G*A*A*C*C*A*+G*+A*+T(A05003HM)、+G*+C*+A*T*A*G*G*C*C*T*G*+G*+A*+C(A05004H)、+C*+T*+C*G*A*C*A*C*T*T*G*G*+T*+G(A050005HM)、+A*+C*+T*C*G*A*C*A*C*T*T*+G*+G*+T(A05006HM)、+G*+G*+C*A*C*T*C*G*A*C*A*+C*+T*+T(A05007HM)、+G*+T*+C*C*T*C*C*C*A*C*C*A*+C*+G*+A(A05010HM)、+G*+T*C*C*T*C*C*C*A*C*C*A*C*G*+A(A05011HM)、+T*+G*T*C*C*T*C*C*C*A*C*C*+A*+C*+G(A05012HM)、+G*+A*G*T*G*T*C*C*T*C*C*C*A*C*+C(A05013HM)、+T*+C*+G*A*C*A*C*T*T*G*G*T*+G*+C*+A(A05014HM)、+C*+T*+C*G*A*C*A*C*T*T*G*G*+T*+G*+C(A05015HM)、+A*+C*+T*C*G*A*C*A*C*T*T*+G*G*T*+G(A05016HM)、+C*+A*+C*T*C*G*A*C*A*C*T*T*+G*+G*+T(A05017HM)、+T*+G*+T*C*C*T*C*C*C*A*C*C*A*+C*+G*+A(A05020HM)、+G*+T*G*T*C*C*T*C*C*C*A*C*C*+A*+C*+G(A05021HM)、+G*+A*G*T*G*T*C*C*T*C*C*C*A*C*+C*+A(A05022HM)、+G*T*+G*T*T*G*G*A*G*T*G*T*C*C*+T*+C(A05023HM)、+C*+...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗兰克·亚申斯基，塔玛拉·希尔梅纽克，
申请(专利权)人：瑟卡尔纳制药有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE