新型天冬氨酸激酶变体和使用其生产L-氨基酸的方法技术

本申请涉及天冬氨酸激酶变体，包括该变体的微生物，和通过使用该微生物用于生产天冬氨酸衍生的L‑氨基酸或其高丝氨酸衍生物的方法。

Novel aspartate kinase variants and methods for producing L-amino acids using them

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型天冬氨酸激酶变体和使用其生产L-氨基酸的方法
本公开内容涉及天冬氨酸激酶变体，包含该变体的微生物，以及通过使用该微生物生产天冬氨酸衍生的L-氨基酸或其氨基酸衍生物的方法。
技术介绍
棒状杆菌属特别是谷氨酸棒杆菌的微生物是广泛用于生产L-氨基酸和其它有用物质的革兰氏阳性微生物。为了生产L-氨基酸和其它有用物质，已经进行了各种研究以开发用于发酵过程的高效生产微生物和技术。例如，主要使用通过增加编码参与L-赖氨酸生物合成酶的基因的表达或通过敲除生物合成不必要的基因来特异性接近靶物质的方法(韩国专利号10-0838038)。同时，在L-氨基酸中，L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸和L-甘氨酸是衍生自天冬氨酸(Asp)的氨基酸，并且这些氨基酸通常使用通过天冬氨酸激酶(LysC,E.C.2.7.2.4)由Asp产生的天冬氨酰磷酸(App)(图1)。因此，为了通过微生物发酵方法生产氨基酸，重要的是使生物合成途径中使用的酶的活性维持在一定水平或更高水平，并且因此在这方面进行了深入研究。具体地，已知通过L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制来调节LysC——其作为天冬氨酸衍生的氨基酸的生物合成途径中的第一种酶——的活性(JMolBiol.2007Apr27；368(2)：521-36.Epub2007年2月20日)。在这方面，尽管已经提交了与反馈抑制相关的应用(美国专利号US8062869B和日本专利号JP3473042B)，但是仍需要继续研究以提高天冬氨酸衍生产物的生产力。在这种情况下，本专利技术人通过确认当使用新型天冬氨酸激酶变体时天冬氨酸衍生的L-氨基酸或其氨基酸衍生物的产生得到改善而完成本公开内容。
技术实现思路
技术问题本专利技术的一个目的是提供一种天冬氨酸激酶变体，其包括在SEQIDNO：1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸取代包括用L-赖氨酸或L-甲硫氨酸取代SEQIDNO：1的氨基酸序列中第377位的氨基酸。本公开内容的另一个目的是提供编码变体的多核苷酸。本公开内容的仍另一个目的是提供生产天冬氨酸衍生的L-氨基酸或其氨基酸衍生物的棒状杆菌属的微生物，该微生物包括天冬氨酸激酶变体或具有其增强的活性。本公开内容的仍另一个目的是提供用于生产天冬氨酸衍生的L-氨基酸或其氨基酸衍生物的方法，包括：在培养基中培养微生物；和从培养的微生物或培养基中回收天冬氨酸衍生的L-氨基酸或其氨基酸衍生物。本公开内容的仍另一个目的是提供用于生产甲硫氨酸的方法，其包括：在培养基中培养微生物；从培养的微生物或培养基生产乙酰高丝氨酸或琥珀酰高丝氨酸；和将乙酰高丝氨酸或琥珀酰高丝氨酸转化为甲硫氨酸。技术方案在下文中将详细描述本公开内容。同时，本文公开的每个解释和示例性实施方式可以应用于其他解释和示例性实施方式。也就是说，本文公开的各种因素的所有组合都属于本公开内容的范围。此外，本公开内容的范围不应被下文提供的具体公开内容所限制。此外，基于常规实验，本领域普通技术人员将能够识别或确认本申请中描述的本公开内容的具体实施方式的许多等同物，并且这些等同物旨在包括在本公开内容中。为了实现上述目的，本公开内容的一个方面提供了一种天冬氨酸激酶变体，其包括在SEQIDNO：1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代，其中氨基酸取代包括用另一种氨基酸取代第377位的氨基酸。具体地，本公开内容的目的是提供一种天冬氨酸激酶变体，其中SEQIDNO：1的氨基酸序列中第377位的氨基酸被L-赖氨酸或L-甲硫氨酸取代。如本文所使用，术语“天冬氨酸激酶”是指催化氨基酸、天冬氨酸的磷酸化，并且在生物合成三种必需氨基酸L-甲硫氨酸、L-赖氨酸和L-苏氨酸——其被称为天冬氨酸家族——的第一步中起作用的酶。在本公开内容中，术语“天冬氨酸激酶”可以与“LysC”或“LysC蛋白”互换使用。LysC蛋白可以从已知数据库NCBI的GenBank获得。LysC蛋白可以是衍生自棒状杆菌属的LysC，并且具体地，可以是衍生自谷氨酸棒杆菌的具有SEQIDNO：1的氨基酸序列的多肽，但是不限于此。此外，本公开内容中的LysC可以是由SEQIDNO：1的氨基酸序列或与其具有80％、85％、90％、95％或者97％或更高的同源性或同一性的氨基酸序列组成的多肽。此外，显而易见的是，具有缺失、修饰、取代或添加序列的一部分的氨基酸序列的多肽也包括在本公开内容的范围内，只要该氨基酸序列具有这种同源性或同一性并展现出对应于多肽的同源性或同一性的效果。在本公开内容中，本领域众所周知的各种方法可用于获得天冬氨酸激酶(LysC)的方法。这种方法的实例包括基因合成技术，其包括优化密码子以便在棒状杆菌属的微生物中高效获得酶，该基因合成技术通常用于酶的表达，以及使用基于微生物的元基因组的生物信息学方法筛选有用酶资源的方法，但方法不限于此。如本文所使用，术语“变体”是这样的多肽，其中至少一个氨基酸与在保守取代和/或修饰中叙述的多肽不同，使得保留该多肽的功能或性质。变体多肽通过几个氨基酸的取代、缺失或添加与鉴定的序列不同。通常可以通过修饰上述多肽序列中的一个并评估修饰多肽的性质来鉴定这种变体。换句话说，相对于天然蛋白质，变体的能力可以增强、不变或减弱。通常可以通过修饰上述多肽序列中的一个并评估修饰多肽的反应性来鉴定这种变体。此外，一部分变体可以包括其中已除去一个或多个部分——比如，N-末端前导序列或跨膜结构域——的那些。其他变体可以包括其中一小部分已从成熟蛋白的N-末端和/或C-末端除去的变体。如本文所使用，“保守取代”是指一种氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代。例如，变体可以具有保留一种或多种生物活性的至少一种保守取代。这种氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。例如，带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；芳族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；和疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。典型地，保守取代对所得多肽的活性几乎没有影响。变体还可以包含其他修饰，包括缺失或添加对多肽的性质和二级结构具有最小影响的氨基酸。例如，多肽可以在蛋白质N-末端处与信号(或前导)序列缀合，该信号(或前导)序列共翻译或翻译后指导蛋白质的转移。多肽还可以与接头或其他序列缀合，以便于多肽的合成、纯化或鉴定。例如，本文要求保护的术语“天冬氨酸激酶变体”具体可以指衍生自棒状杆菌属的具有SEQIDNO：1的氨基酸序列的LysC的修饰多肽，并且可以包括含有在SEQIDNO：1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代的变体。具体地，它可以是包括用SEQIDNO：1的氨基酸序列中的另一个氨基酸取代第377位的氨基酸残基的变体。“其他氨基酸”没有限制，只要它是L-亮氨酸——其为第377位的氨基酸——以外的氨基酸。具体地，例如，可以用赖氨酸或甲硫氨酸取代第377位的氨基酸残基。L-赖氨酸是碱性氨基酸的实例，并且碱性氨基酸可以是L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸中的一种。L-甲硫氨酸是非极性氨基酸的实例，并且非极性氨基酸可以是L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸、L-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种天冬氨酸激酶变体，其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第377位的氨基酸被L‑赖氨酸或L‑甲硫氨酸取代。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.06.30 KR 10-2017-00834371.一种天冬氨酸激酶变体，其中在SEQIDNO：1的氨基酸序列中第377位的氨基酸被L-赖氨酸或L-甲硫氨酸取代。2.编码根据权利要求1所述的变体的多核苷酸。3.一种棒状杆菌属的微生物，其产生天冬氨酸衍生的L-氨基酸或其氨基酸衍生物，其包括根据权利要求1所述的天冬氨酸激酶变体。4.根据权利要求3所述的微生物，其中所述天冬氨酸衍生的L-氨基酸或其氨基酸衍生物选自赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、O-琥珀酰高丝氨酸、异亮氨酸和尸胺。5.根据权利要求3所述的微生物，其中所述棒状杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌。6.一种用于生产天冬氨酸衍生的L-氨基酸或...

【专利技术属性】
技术研发人员：金亨俊，金孝珍，裵贤原，金贤雅，徐昌一，李知宣，张真淑，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR