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检测AAV的方法技术

技术编号:21958596 阅读:235 留言:0更新日期:2019-08-24 21:56
本文提供了用于确定病毒颗粒的血清型和/或确定病毒颗粒(例如,AAV颗粒)的异质性的方法。在其他实施方案中,本发明专利技术提供了确定AAV颗粒的异质性的方法。在一些方面,本发明专利技术通过增加衣壳蛋白的乙酰化和/或脱酰胺化提供了具有改善的稳定性和/或改善的转导效率的病毒颗粒(例如,rAAV颗粒)。

Detection of AAV

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测AAV的方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年8月15日提交的美国临时申请序列号62/375,314的优先权权益,将其通过引用以其整体特此并入。序列表将以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用以其整体并入本文:计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名:159792014140SEQLIST.txt,记录日期:2017年8月14日,大小:51KB)。
本专利技术涉及用于使用质量测定(例如,通过采用液相色谱/质谱(LC/MS)或液相色谱/质谱-质谱(LC/MS/MS))对病毒颗粒(例如,腺相关病毒(AAV)颗粒)进行血清分型和/或确定其异质性的方法。在一些方面,本专利技术涉及改善AAV颗粒的稳定性的方法。
技术介绍
由于病毒衣壳蛋白(VP)对病毒感染性至关重要,因此在基因治疗研究和开发中需要病毒载体(例如,AAV载体)的病毒衣壳蛋白的完整表征,包括它们的序列和翻译后修饰。通常使用靶向核酸转基因的分子工具鉴定病毒载体产物,如重组腺相关病毒(rAAV)产物。这些方法可以包括靶向转基因特异性序列的聚合酶链式反应(PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)技术。随着rAAV技术的发展,许多研究机构开始研究编码其治疗性转基因的多种AAV衣壳血清型,以努力改善靶向组织嗜性。传统的分子鉴定方法鉴定含有独特转基因的产物,但不能辨别具有不同AAV衣壳血清型的那些产物。目前,大多数AAV血清型身份测试基于SDS-PAGE显带模式(SDS-PAGEbandingpattern)、基于抗体的ELISA或Western印迹测定。然而,显带模式和抗体不足以特异性地区分不同的AAV血清型。已经报道凝胶-LC/MS/MS作为一种衣壳血清型鉴定方法。然而,这种方法涉及多个步骤,包括SDS-PAGE、凝胶内消化和LC/MS/MS,并且因此需要多天进行分析,同时提供有限的序列覆盖。用于鉴定诸如rAAV载体等载体的方法是基因治疗载体感兴趣的(参见例如,美国专利授予前公开号US20110275529)。因此,具有改善的表征病毒颗粒的方法将是有用的。本文引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)均通过引用以其整体而并入。
技术实现思路
使用rAAV作为例子,本文描述了使用LC/MS作为分析工具以特异性地鉴定不同的病毒衣壳血清型(例如,rAAV衣壳血清型)。作为病毒表征的一部分,LC/MS可以用于增强分子鉴定方法。这种分析组合可以通过辨别产物的治疗性转基因的身份和衣壳血清型的身份两者来满足监管要求。这种方法可以例如用作AAV血清型身份测试或用于监测重组AAV基因治疗开发中的病毒衣壳蛋白异质性。它还可以用于确认衣壳工程研究中的VP序列。另外,这种技术可以用于研究翻译后修饰(如病毒衣壳蛋白的N末端乙酰化)对转染效力和细胞内蛋白质运输的影响。本文所述的方法还可以用于设计AAV颗粒以获得更高的稳定性和/或改善的转导效率;例如,通过改变AAV衣壳的VP1和/或VP3的2位的氨基酸残基,使得与野生型AAV衣壳相比,2位的氨基酸被乙酰化至更高的程度。在一些实施方案中,该方法可以用于设计具有降低的转导效率的AAV颗粒;例如,通过改变AAV衣壳的VP1和/或VP3的2位的氨基酸残基,使得与野生型AAV衣壳相比,2位的氨基酸被脱乙酰化至更高或更低的程度。在一些方面,本专利技术提供了一种确定病毒颗粒的血清型的方法,其包括a)使该病毒颗粒变性,b)使该变性的病毒颗粒经历液相色谱/质谱(LC/MS),并且c)确定该病毒颗粒的一种或多种衣壳蛋白的质量;其中该一种或多种衣壳蛋白的质量的特定组合指示该病毒血清型。在一些实施方案中,将该一种或多种衣壳蛋白的计算质量与一种或多种病毒血清型的该一种或多种衣壳蛋白的理论质量进行比较。在一些方面,本专利技术提供了一种确定病毒颗粒的异质性的方法,其包括a)使该病毒颗粒变性,b)使该变性的病毒颗粒经历液相色谱/质谱/质谱(LC/MS/MS),c)确定该病毒颗粒的一种或多种衣壳蛋白的质量,并且d)将步骤c)的质量与该病毒血清型的该一种或多种衣壳蛋白的理论质量进行比较;其中该一种或多种衣壳蛋白的质量中的一个或多个的偏差指示病毒衣壳异质性。在一些实施方案中,该异质性包括混合血清型、变体衣壳、衣壳氨基酸取代、截短衣壳或修饰衣壳中的一种或多种。在以上方面的一些实施方案中,该液相色谱是反相液相色谱、尺寸排阻色谱、亲水相互作用液相色谱或阳离子交换色谱。在一些实施方案中,该病毒颗粒包含编码异源转基因的病毒载体。在一些方面,本专利技术提供了一种确定病毒颗粒的血清型的方法,其包括a)使该病毒颗粒变性,b)使该变性的病毒颗粒经历还原和/或烷基化,c)使该变性的病毒颗粒经历消化以产生该病毒颗粒的一种或多种衣壳蛋白的片段,d)使该一种或多种衣壳蛋白的片段经历液相色谱/质谱-质谱(LC/MS/MS),并且e)确定该病毒颗粒的该一种或多种衣壳蛋白的片段的质量;其中该一种或多种衣壳蛋白的片段的质量的特定组合指示该病毒血清型。在一些实施方案中,将该一种或多种衣壳蛋白的片段的计算质量与一种或多种病毒血清型的该一种或多种衣壳蛋白的片段的理论质量进行比较。在一些方面,本专利技术提供了一种确定病毒颗粒的血清型的异质性的方法,其包括a)使该病毒颗粒变性,b)使该变性的病毒颗粒经历还原和/或烷基化,c)使该变性的病毒颗粒经历消化以产生该病毒颗粒的一种或多种衣壳蛋白的片段,d)使该一种或多种衣壳蛋白的片段经历液相色谱/质谱-质谱(LC/MS/MS),e)确定该病毒颗粒的该一种或多种衣壳蛋白的片段的质量,并且f)将步骤e)的质量与该病毒血清型的该一种或多种衣壳蛋白的片段的理论质量进行比较;其中该一种或多种衣壳蛋白的质量中的一个或多个的偏差指示病毒衣壳异质性。在一些实施方案中,该异质性包括混合血清型、变体衣壳、衣壳氨基酸取代、截短衣壳或修饰衣壳中的一种或多种。在一些实施方案中,该液相色谱是反相液相色谱、尺寸排阻色谱、亲水相互作用液相色谱或阳离子交换色谱。如本文所示,该方法可以在不存在凝胶分离步骤(例如,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE))的情况下进行。在以上方面和实施方案的一些实施方案中,该病毒颗粒包含编码异源转基因的病毒载体。在一些实施方案中,该病毒颗粒属于选自以下的病毒科:腺病毒科(Adenoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)和疱疹病毒科(Herpesviridae)。在一些实施方案中,该病毒颗粒属于选自以下的病毒属:腺胸腺病毒属(Atadenovirus)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)、美洲白鲟腺病毒属(Ichtadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)、唾液酸酶腺病毒属(Siadenovirus)、双义浓核病毒属(Ambidensovirus)、短浓核病毒属(Brevidensovirus)、虾肝胰腺浓核病毒属(Hepandensovirus)、重复浓核病毒属(Iteradensovirus)、对虾浓核病毒属(Penstyldensovirus)、水貂阿留申细小病毒属(Amdoparvovirus)、Aveparvovirus、博本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种确定腺相关病毒(AAV)颗粒的血清型的方法,其包括a)使该AAV颗粒变性,b)使该变性的AAV颗粒经历液相色谱/质谱(LC/MS),并且c)确定该AAV颗粒的VP1、VP2和VP3的质量;其中VP1、VP2和VP3的质量的特定组合指示该AAV血清型。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.15 US 62/375,3141.一种确定腺相关病毒(AAV)颗粒的血清型的方法,其包括a)使该AAV颗粒变性,b)使该变性的AAV颗粒经历液相色谱/质谱(LC/MS),并且c)确定该AAV颗粒的VP1、VP2和VP3的质量;其中VP1、VP2和VP3的质量的特定组合指示该AAV血清型。2.权利要求1的方法,其中将VP1、VP2和VP3的计算质量与一种或多种AAV血清型的VP1、VP2和VP3的理论质量进行比较。3.一种确定AAV颗粒的异质性的方法,其包括a)使该AAV颗粒变性,b)使该变性的AAV颗粒经历液相色谱/质谱/质谱(LC/MS/MS),c)确定该AAV颗粒的VP1、VP2和VP3的质量,并且d)将步骤c)的质量与该AAV血清型的VP1、VP2和VP3的理论质量进行比较;其中VP1、VP2或VP3的质量中的一个或多个的偏差指示AAV衣壳异质性。4.权利要求3的方法,其中该异质性包括混合血清型、变体衣壳、衣壳氨基酸取代、截短衣壳或修饰衣壳中的一种或多种。5.权利要求1-4中任一项的方法,其中用乙酸、盐酸胍和/或有机溶剂使该AAV颗粒变性。6.权利要求1-5中任一项的方法,其中该液相色谱是反相液相色谱、尺寸排阻色谱、亲水相互作用液相色谱或阳离子交换色谱。7.权利要求1-6中任一项的方法,其中该液相色谱是反相液相色谱。8.权利要求7的方法,其中该反相色谱是C4或C8反向色谱。9.权利要求8的方法,其中该色谱使用包含甲酸水溶液的流动相A。10.权利要求9的方法,其中该流动相A包含约0.1%甲酸。11.权利要求8-10中任一项的方法,其中该色谱包含流动相B,其包含甲酸乙腈溶液。12.权利要求11的方法,其中该流动相B包含约0.1%甲酸。13.权利要求11或12的方法,其中该色谱中流动相B的比例随时间增加。14.权利要求13的方法,其中该色谱中流动相B的比例以逐步方式增加。15.权利要求14的方法,其中流动相B从约10%增加到约20%,从约20%增加到约30%,并且从约30%增加到约38%。16.权利要求15的方法,其中流动相B在约6分钟内从约10%增加到约20%,在约10分钟内从约20%增加到约30%,并且在约40分钟内从约30%增加到约38%。17.权利要求1-16中任一项的方法,其中该液相色谱是超高效液相色谱(UPLC)。18.权利要求1-17中任一项的方法,其中该质谱包括约3.5kV的毛细管电压。19.权利要求1-18中任一项的方法,其中该质谱包括约45V的采样锥电压。20.权利要求1-19中任一项的方法,其中该质谱包括辅助校准。21.权利要求20的方法,其中将碘化钠用作校准物。22.权利要求1-21中任一项的方法,其中VP1和/或VP3的N末端被乙酰化。23.权利要求1-22中任一项的方法,其中该AAV颗粒是重组AAV(rAAV)颗粒。24.权利要求1-23中任一项的方法,其中该AAV颗粒包含AAV1衣壳、AAV2衣壳、AAV3衣壳、AAV4衣壳、AAV5衣壳、AAV6衣壳、AAV7衣壳、AAV8衣壳、AAVrh8衣壳、AAV9衣壳、AAV10衣壳、AAVrh10衣壳、AAV11衣壳、AAV12衣壳、AAVLK03衣壳、AAV2R471A衣壳、AAV2/2-7m8衣壳、AAVDJ衣壳、AAVDJ8衣壳、AAV2N587A衣壳、AAV2E548A衣壳、AAV2N708A衣壳、AAVV708K衣壳、山羊AAV衣壳、AAV1/AAV2嵌合衣壳、牛AAV衣壳、小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1(嵌合AAV/人博卡病毒1)、AAV2HBKO衣壳、AAVPHP.B衣壳或AAVPHP.eB衣壳。25.权利要求23或24的方法,其中该AAV衣壳包含酪氨酸突变或肝素结合突变。26.权利要求1-25中任一项的方法,其中将VP1、VP2和VP3的质量与AAV1衣壳、AAV2衣壳、AAV3衣壳、AAV4衣壳、AAV5衣壳、AAV6衣壳、AAV7衣壳、AAV8衣壳、AAVrh8衣壳、AAV9衣壳、AAV10衣壳、AAVrh10衣壳、AAV11衣壳、AAV12衣壳、AAVLK03衣壳、AAV2R471A衣壳、AAV2/2-7m8衣壳、AAVDJ衣壳、AAVDJ8衣壳、AAV2N587A衣壳、AAV2E548A衣壳、AAV2N708A衣壳、AAVV708K衣壳、山羊AAV衣壳、AAV1/AAV2嵌合衣壳、牛AAV衣壳、小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1(嵌合AAV/人博卡病毒1)、AAV2HBKO衣壳、AAVPHP.B衣壳或AAVPHP.eB衣壳中的一种或多种的理论质量进行比较。27.权利要求1-26中任一项的方法,其中该病毒颗粒包含AAV1ITR、AAV2ITR、AAV3ITR、AAV4ITR、AAV5ITR、AAV6ITR、AAV7ITR、AAV8ITR、AAVrh8ITR、AAV9ITR、AAV10ITR、AAVrh10ITR、AAV11ITR或AAV12ITR。28.权利要求1-27中任一项的方法,其中该AAV颗粒包含编码异源转基因的AAV载体。29.一种确定腺相关病毒(AAV)颗粒的血清型的方法,其包括a)使该AAV颗粒变性,b)使该变性的AAV颗粒经历还原和/或烷基化,c)使该变性的AAV颗粒经历消化以产生该AAV颗粒的VP1、VP2和/或VP3的片段,d)使VP1、VP2和/或VP3的片段经历液相色谱/质谱-质谱(LC/MS/MS),并且e)确定该AAV颗粒的VP1、VP2和VP3的片段的质量;其中VP1、VP2和VP3的片段的质量的特定组合指示该AAV血清型。30.权利要求29的方法,其中将VP1、VP2和/或VP3的片段的计算质量与一种或多种AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3的片段的理论质量进行比较。31.一种确定AAV颗粒的血清型的异质性的方法,其包括a)使该AAV颗粒变性,b)使该变性的AAV颗粒经历还原和/或烷基化,c)使该变性的AAV颗粒经历消化以产生该AAV颗粒的VP1、VP2和/或VP3的片段,d)使VP1、VP2和/或VP3的片段经历液相色谱/质谱-质谱(LC/MS/MS),e)确定该AAV颗粒的VP1、VP2和VP3的片段的质量,并且f)将步骤e)的质量与该AAV血清型的VP1、VP2和VP3的片段的理论质量进行比较;其中VP1、VP2或VP3的质量中的一个或多个的偏差指示AAV衣壳异质性。32.权利要求31的方法,其中该异质性包括混合血清型、变体衣壳、衣壳氨基酸取代、截短衣壳或修饰衣壳中的一种或多种。33.权利要求29-32中任一项的方法,其中该还原是通过使该AAV颗粒经历二硫苏糖醇、β-巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦(TCEP)来进行。34.权利要求29-33中任一项的方法,其中该烷基化是通过使该AAV颗粒经历碘乙酸、碘乙酰胺或4-乙烯基吡啶来进行。35.权利要求29-34中任一项的方法,其中该消化是酶消化或化学消化。36.权利要求35的方法,其中该酶消化是内肽酶消化。37.权利要求35或36的方法,其中该酶消化是胰蛋白酶消化、LysC消化、Asp-N消化或Glu-C消化。38.权利要求35的方法,其中该化学消化是溴化氰消化或酸消化。39.权利要求29-37中任一项的方法,其中用乙酸、盐酸胍和/或有机溶剂使该AAV颗粒变性。40.权利要求29-39中任一项的方法,其中该液相色谱是反相液相色谱、尺寸排阻色谱、亲水相互作用液相色谱或阳离子交换色谱。41.权利要求29-40中任一项的方法,其中该液相色谱是反相液相色谱。42.权利要求41的方法,其中该反相色谱是C18反向色谱。43.权利要求42的方法,其中该色谱使用包含甲酸水溶液的流动相A。44.权利要求43的方法,其中该流动相A包含约0.1%甲酸。45.权利要求42-44中任一项的方法,其中该色谱包含流动相B,其包含甲酸乙腈溶液。46.权利要求45的方法,其中该流动相B包含约0.1%甲酸。47.权利要求45或46的方法,其中该色谱中流动相B的比例随时间增加。48.权利要求47的方法,其中流动相B从约2%增加到约60%。49.权利要求48的方法,其中流动相B在约121分钟内从约2%增加到约60%。50.权利要求29-49中任一项的方法,其中该液相色谱是高效液相色谱(HPLC)。51.权利要求29-50中任一项的方法,其中该质谱包括约2.5kV的源电压。52.权利要求29-51中任一项的方法,其中该质谱包括约275℃的毛细管温度。53.权利要求29-52中任一项的方法,其中该质谱的S透镜RF电平为约55%。54.权利要求29-53中任一项的方法,其中VP1和/或VP3的N末端被乙酰化。55.权利要求29-54中任一项的方法,其中该AAV颗粒是重组AAV(rAAV)颗粒。56.权利要求29-55中任一项的方法,其中该AAV颗粒包含AAV1衣壳、AAV2衣壳、AAV3衣壳、AAV4衣壳、AAV5衣壳、AAV6衣壳、AAV7衣壳、AAV8衣壳、AAVrh8衣壳、AAV9衣壳、AAV10衣壳、AAVrh10衣壳、AAV11衣壳、AAV12衣壳、AAVLK03衣壳、AAV2R471A衣壳、AAV2/2-7m8衣壳、AAVDJ衣壳、AAVDJ8衣壳、AAV2N587A衣壳、AAV2E548A衣壳、AAV2N708A衣壳、AAVV708K衣壳、山羊AAV衣壳、AAV1/AAV2嵌合衣壳、牛AAV衣壳、小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1(嵌合AAV/人博卡病毒1)、AAV2HBKO衣壳、AAVPHP.B衣壳或AAVPHP.eB衣壳。57.权利要求55或56的方法,其中该AAV衣壳包含酪氨酸突变、肝素结合突变或HBKO突变。58.权利要求29-57中任一项的方法,其中将VP1、VP2和VP3的质量与AAV1衣壳、AAV2衣壳、AAV3衣壳、AAV4衣壳、AAV5衣壳、AAV6衣壳、AAV7衣壳、AAV8衣壳、AAVrh8衣壳、AAV9衣壳、AAV10衣壳、AAVrh10衣壳、AAV11衣壳、AAV12衣壳、AAVLK03衣壳、AAV2R471A衣壳、AAV2/2-7m8衣壳、AAVDJ衣壳、AAVDJ8衣壳、AAV2N587A衣壳、AAV2E548A衣壳、AAV2N708A衣壳、AAVV708K衣壳、山羊AAV衣壳、AAV1/AAV2嵌合衣壳、牛AAV衣壳、小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1(嵌合AAV/人博卡病毒1)、AAV2HBKO衣壳、AAVPHP.B衣壳或AAVPHP.eB衣壳中的一种或多种的理论质量进行比较。59.权利要求29-58中任一项的方法,其中该病毒颗粒包含AAV1ITR、AAV2ITR、AAV3ITR、AAV4ITR、AAV5ITR、AAV6ITR、AAV7ITR、AAV8ITR、AAVrh8ITR、AAV9ITR、AAV10ITR、AAVrh10ITR、AAV11ITR或AAV12ITR。60.权利要求29-59中任一项的方法,其中该AAV颗粒包含编码异源转基因的AAV载体。61.一种确定AAV颗粒的血清型的方法,其包括权利要求1、2或4-28中任一项的方法连同权利要求29、30或32-59中任一项的方法。62.一种确定AAV颗粒的异质性的方法,其包括权利要求3-28中任一项的方法连同权利要求31-60中任一项的方法。63.一种重组AAV(rAAV)颗粒,其包含在VP1和/或VP3或亲本多肽的氨基酸残基2处的氨基酸取代;其中与该亲本AAV颗粒的VP1和/或VP3的氨基酸残基2处的N末端乙酰化相比,VP1和/或VP3的氨基酸残基2处的该氨基酸取代改变了N末端乙酰化。64.权利要求63的rAAV颗粒,其中该取代导致更高频率的N末端乙酰化或更低频率的N末端乙酰化。65.权利要求63或64的rAAV颗粒,其中该rAAV颗粒包含在VP1的氨基酸残基2处的氨基酸取代;并且其中与该亲本AAV颗粒的VP1的氨基酸残基2处的N末端乙酰化相比,VP1的氨基酸残基2处的该氨基酸取代改变了N末端乙酰化。66.权利要求63-65中任一项的rAAV颗粒,其中该rAAV颗粒包含在VP3的氨基酸残基2处的氨基酸取代;并且其中与该亲本AAV颗粒的VP3的氨基酸残基2处的N末端乙酰化相比,VP3的氨基酸残基2处的该氨基酸取代改变了N末端乙酰化。67.权利要求63-66中任一项的rAAV颗粒,其中该氨基酸残基2被Cys、Ser、Thr、Val、Gly、Asn、Asp、Glu、Ile、Leu、Phe、Gln、Lys、Met、Pro或Tyr取代。68.权利要求67的rAAV颗粒,其中该氨基酸残基2被Ser、Asp或Glu取代。69.权利要求63-68中任一项的rAAV颗粒,其中该AAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAVLK03、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAVDJ、AAVDJ8衣壳、AAV2N587A、AAV2E548A、AAV2N708A、AAVV708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合体、牛AAV、小鼠AAV、rAAV2/HBoV1血清型衣壳、AAV2HBKO、AAVPHP.B或AAVPHB.eB血清型衣壳。70.权利要求63-69中任一项的rAAV颗粒,其在该颗粒的衣壳中包含酪氨酸突变或肝素结合突变。71.权利要求63-70中任一项的rAAV颗粒,其中该rAAV颗粒包含rAAV载体。72.权利要求71的rAAV颗粒,其中该rAAV载体包含一个或多个AAVITR。73.权利要求71或72的rAAV颗粒,其中该rAAV载体包含AAV1ITR、AAV2ITR、AAV3ITR、AAV4ITR、AAV5ITR、AAV6ITR、AAV7ITR、AAV8ITR、AAVrh8ITR、AAV9ITR、AAV10ITR、AAVrh10ITR、AAV11ITR或AAV12ITR。74.权利要求72或73的rAAV颗粒,其中该AAV衣壳和该AAVITR衍生自相同的血清型。75.权利要求72或73的rAAV颗粒,其中该AAV衣壳和该AAVITR衍生自不同的血清型。76.权利要求71-75中任一项的rAAV颗粒,其中该AAV颗粒包含编码侧接一个或多个AAVITR的异源转基因的AAV载体。77.权利要求71-76中任一项的rAAV颗粒,其中该rAAV载体是自身互补的载体。78.权利要求77的rAAV颗粒,其中该rAAV载体包含编码该转基因的第一核酸序列和编码该转基因的互补序列的第二核酸序列,其中该第一核酸序列可以与该第二核酸序列沿着其大部分或所有长度形成链内碱基对。79.权利要求78的rAAV颗粒,其中该第一核酸序列和该第二核酸序列通过突变的AAVITR连接,其中该突变的AAVITR包含D区的缺失并且包含末端解析序列的突变。80.权利要求63-79中任一项的rAAV颗粒,其中该rAAV颗粒是通过以下方式产生的:用编码该rAAV载体的核酸和编码AAVrep和cap功能的核酸转染宿主细胞,并且提供编码AAV辅助功能的核酸。81.权利要求80的rAAV颗粒,其中通过用编码该AAV辅助功能的核酸转染该宿主细胞来提供该AAV辅助功能。82.权利要求81的rAAV颗粒,其中通过用提供该AAV辅助功能的AAV辅助病毒感染该宿主细胞来提供该AAV辅助功能。83.权利要求82的rAAV颗粒,其中该AAV辅助病毒是腺病毒、单纯疱疹病毒或杆状病毒。84.权利要求63-79中任一项的rAAV颗粒,其中该rAAV颗粒由AAV生产细胞产生,该AAV生产细胞包含编码该rAAV载体的核酸和编码AAVrep和cap功能的核酸并且提供编码AAV辅助功能的核酸。85.权利要求84的rAAV颗粒,其中该AAV生产细胞包含编码AAV辅助功能的核酸。86.权利要求84的rAAV颗粒,其中通过用提供该AAV辅助功能的AAV辅助病毒感染该AAV生产细胞来提供该AAV辅助功能。87.权利要求86的rAAV颗粒,其中该AAV辅助病毒是腺病毒、单纯疱疹病毒或杆状病毒。88.权利要求80-87中任一项的rAAV颗粒,其中该AAVcap功能提供了在VP1和/或VP3的氨基酸残基2处的氨基酸取代,其中与该亲本AAV颗粒的VP1和/或VP3的氨基酸残基2处的N末端乙酰化相比,VP1和/或VP3的氨基酸残基2处的该氨基酸取代改变了N末端乙酰化。89.一种药物组合物,其包含权利要求63-88中任一项的rAAV颗粒。90.一种试剂盒,其包含权利要求63-87中任一项的rAAV颗粒或权利要求89的药物组合物。91.一种制品,其包含权利要求63-87中任一项的rAAV颗粒或权利要求89的药物组合物。92.一种AAV衣壳蛋白,其包含在亲本AAV衣壳蛋白的氨基酸残基2处的氨基酸取代;其中与该亲本AAV衣壳蛋白的氨基酸残基2处的N末端乙酰化相比,氨基酸残基2处的该氨基酸取代改变了N末端乙酰化。93.权利要求92的AAV衣壳蛋白,其中该取代导致更高频率的N末端乙酰化或更低频率的N末端乙酰化。94.权利要求92或93的AAV衣壳蛋白,其中该AAV衣壳蛋白是VP1或VP3。95.权利要求92-94中任一项的AAV衣壳蛋白,其中氨基酸残基2被Cys、Ser、Thr、Val、Gly、Asn、Asp、Glu、Ile、Leu、Phe、Gln、Lys、Met、Pro或Tyr取代。96.权利要求93的AAV衣壳蛋白,其中氨基酸残基2被Ser、Asp或Glu取代。97.权利要求92-96中任一项的AAV衣壳蛋白,其中该氨基酸取代导致该AAV衣壳的更少脱酰胺化。98.权利要求92-97中任一项的AAV衣壳蛋白,其包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAVLK03、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAVDJ、AAVDJ8衣壳、AAV2N587A、AAV2E548A、AAV2N708A、AAVV708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合体、牛AAV、小鼠AAV、rAAV2/HBoV1、AAV2HBKO、AAVPHP.B或AAVPHP.eB血清型衣壳。99.权利要求92-98中任一项的rAAV衣壳蛋白,其中该AAV衣壳蛋白还包含酪氨酸突变或肝素结合突变。100.一种改善rAAV颗粒的稳定性的方法,其包括取代亲本VP1和/或VP3的VP1和/或VP3的氨基酸残基2;其中与该亲本...

【专利技术属性】
技术研发人员:X·金C·R·奥里奥登L·刘K·张
申请(专利权)人:建新公司
类型:发明
国别省市:美国,US

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