用于病毒生产的新型猪细胞系制造技术

本发明专利技术涉及能够在不含动物来源成分的培养基中增殖的连续猪细胞系。本发明专利技术进一步涉及使用所述细胞系生产病毒的方法以及可通过所述方法获得的病毒。此外，本发明专利技术涉及使用所述细胞系从环境样品中积聚病毒的方法以及可通过所述方法获得的病毒。

A new swine cell line for virus production

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于病毒生产的新型猪细胞系
本专利技术涉及能够在不含动物来源成分的培养基中增殖的连续猪细胞系。此外，本专利技术涉及使用所述细胞系生产病毒的方法以及可通过所述方法获得的病毒。另外，本专利技术涉及使用所述细胞系从环境样品中积聚病毒的方法以及可通过所述方法获得的病毒。
技术介绍
甲型流感病毒(InfluenzaAviruses)(AIV，甲型流感病毒属(InfluenzavirusAgenus)，正粘病毒科(Orthomyxoviridaefamily))均具有在家禽养殖场和猪养殖场中引起急性暴发和建立亚临床存在的能力。它们还以高人畜共患(zoonotic)且危险的大流行潜力而闻名[1-4]。通常与爆发相关的AIV毒株属于由16种血凝素(HA，称为H1-H16)亚型和9种神经氨酸酶(NA，N1-N9)亚型所组成的组[3]。最近发现了另外的流感病毒，其为感染蝙蝠的H17和H18亚型[5]和在反刍动物中发现的丁型流感病毒(influenzaDviruses)[6]。这些流感病毒以及乙型流感病毒(influenzaBviruses)似乎与H1-H16AIV高的大流行潜力无关。AIV的致病性是由多种因素决定的，这些因素从嗜性(例如，感染下呼吸道的病毒往往比在上部区域复制的病毒导致更严重的疾病)到与先天免疫的相互作用(诱导高细胞因子血症(hypercytokinemia)或“细胞因子风暴(cytokinestorms)”的毒株的病死率更高)[7,8]。嗜性和宿主范围主要由病毒粒子表面上的血凝素和神经氨酸酶蛋白(分别为HA和NA)以及非结构蛋白PB2(病毒RNA聚合酶的亚基)决定。一些HA和NA亚型更常与大爆发或严重疾病相关(例如，H1N1、H2N2和H3N2过去曾引起大流行，H5N1和H7N9的出现因危险的宿主范围变化目前正受到密切监测)[8,9]。其它毒株(如H9N2)的毒力似乎较小，但仍可具有流行病学重要性。例如，H9N2病毒会削弱动物对随后的继发性细菌和病毒感染的抵抗[10]。同时流行的H9N2病毒在中国和埃及也是一个问题，因为内部(非HA或NA)基因可使所接受的病毒的库集(repertoire)扩大到更高的致病潜力[11-14]。由于AIV将其基因组信息分布在八个区段(每个区段为负义线性单链RNA分子)，因此促进了此种基因交换。病毒染色体可在对不同毒株敏感的动物(特别是猪)的共感染时被重配(re-assort)，并且可产生在毒力、宿主范围和大流行潜力方面具有明显转变的病毒[15]。家禽暴露是人感染AIV的主要危险因素[9,16]。AIV感染也会对家禽养殖场和猪养殖场造成严重的经济破坏。通过监测、遏制策略、受感染动物的剔除和免疫接种的组合，一直对它们进行着控制[17,18]。使用低致病性AIV(LPAIV)作为产生种子，用灭活的制剂(非活的减毒病毒)进行动物免疫接种[18]。疫苗一直是在含胚鸡卵或原代鸡胚成纤维细胞中进行制造。在亚洲、北美和北非的多个地区，已经使用各种各样的毒株来预防H9N2病毒、H5N2病毒、H5N1病毒、H7N3病毒、H7N7病毒的感染[18]。由于以下特性的组合，流感病毒流行病学是复杂的：(1)不同的病毒株的毒力可不同，范围从不明显的感染到急性感染。尤其是迁徙的鸭可作为移动的库，其中病毒从表面上看起来健康的群溢出到未得到适当保障的饲养猪或鸡的厂中。(2)流感病毒的基因组信息被组织在不同的RNA片段中，这些不同的RNA片段可在感染有一种以上毒株的宿主细胞中被重配进新的毒株中。这允许传染性质和大流行性质的快速转变。(3)猪特别容许各种来源的流感病毒，并可加速重配(re-assortants)的产生。(4)猪养殖和鸡养殖属于最具动态的农业部门，具有庞大的全球动物种群和广泛的商品交换，包括活体动物和可能受污染的衍生产品。鸡和猪经常被饲养在适合流感病毒交换的附近。本专利申请的专利技术人开发了一种新型且有利的连续猪细胞系，其能够在不含动物来源成分的培养基中增殖。该细胞系容易允许环境样品中存在的病毒的积聚。所述细胞系具有容许广泛的病毒谱(包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和丁型流感病毒以及蝙蝠来源的毒株)的优点。对诸如低致病性禽流感病毒(LPAIV)的病毒的高容许性是非常期望的性质，因为此类病毒制剂可用作紧急疫苗。传统上将含胚卵用于分离流感病毒并用于产生疫苗。与当前产生系统相关的问题是：某些毒株的产量低，因此需要昂贵的浓缩步骤来提高效价；大量的卵壳，如果一直在卵腔中产生疫苗，其作为生物危害性固体废物被遗留下来；以及依赖于不含外来试剂的含胚卵的连续供应[18-20]。通过临近产生现场建立繁殖基地来实现对含胚卵供应控制的改善，但这需要巨大的成本[21]。负担能力和供应安全也可能受对卵的依赖的影响[22]。据报道，某些禽类疫苗总产生成本的三分之一来自于原代鸡细胞的制备[23]。必须适应养殖、卵的收获和疫苗种子接种之间的刚性间隔[24]，并且环境物质和内源性物质污染的风险增加[20,25,26]。即使代替更昂贵的无特定病原体状态的群而用来自表面上看起来健康的群的含胚卵生产疫苗，也仅部分缓解资源压力。尤其是，用健康状况较不明确的含胚卵，可感染家禽并在家禽中流行并且可能对常见的失活方法不是都敏感的广谱支原体可能会使疫苗的产生恶化[27]。MDCK细胞系补充了流感病毒研究和疫苗生产中的含胚卵。StewartMadin和NormanDarby于1958年由成年可卡犬的原代肾细胞建立了这种连续细胞系。一些MDCK细胞谱系高度容许甲型流感病毒或乙型流感病毒的多种毒株。基于这种性质的组合，开发出了用于抵抗季节性流感的灭活疫苗的基于MDCK的生产工艺。2007年发放了对在MDCK培养物(OPTAFLU，Novartis)中生产的三价亚单位流感疫苗的首次监管批准[28,29]。由于与含胚卵具有一样的效率，并且MDCK细胞可用于多种流感病毒的繁殖，一些病毒分离株根本不复制，或者无法复制至传统系统中疫苗生产所需的水平[4,30]。已知猪来源的病毒毒株具有引起疾病流行性爆发的能力[31]，因此猪来源的新型细胞基质具有对猪来源的病毒的天然容许性，可改善疫苗供应的安全性。此外，犬科MDCK细胞系来源于与病毒大流行(例如流感病毒大流行)在流行病学上不相关的物种。关于疫苗(例如流感疫苗)的另一问题是疫苗中包含的抗原与流行的病毒所展示的抗原之间的不匹配可严重降低疫苗效力[32]。现有疫苗中存在的给定毒株在未来可能主导病毒活动(例如流感活动)的程度很难预测，并且是疫苗不匹配的一个来源。如果正确选择的季节性毒株适应生产方案，疫苗不匹配也可能发生。其结果可能是由所产生的病毒表达的抗原不针对由流行的毒株所展示的表位进行保护。先前已经描述了流感病毒对含胚卵或MDCK细胞基质的此类不利适应[32]。因此，需要一种不具有上述缺点的新细胞系。本专利申请的专利技术人开发了一种新型且有利的连续猪细胞系，其能够在不含动物来源成分的培养基中增殖。该细胞系允许以高产量生产病毒(例如流感病毒)。所述病毒可用作疫苗。该细胞系还减轻了病毒的选择压力，从而干扰结构基因中突变的积累。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术涉及连续猪细胞系，所述连续猪细胞系能够在不含动物来源成分的培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种连续猪细胞系，所述连续猪细胞系能够在不含动物来源成分的培养基中增殖。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种连续猪细胞系，所述连续猪细胞系能够在不含动物来源成分的培养基中增殖。2.如权利要求1所述的连续猪细胞系，其中，所述细胞系是非贴壁细胞系。3.如权利要求1或2所述的连续猪细胞系，其中，所述细胞系为容许病毒的细胞系。4.如权利要求3所述的连续猪细胞系，其中，所述细胞系感染有所述病毒，或者所述细胞系转染有携带编码所述病毒的核酸序列的质粒。5.如权利要求3或4所述的连续猪细胞系，其中，所述病毒携带蛋白酶切割位点。6.如权利要求5所述的连续猪细胞系，其中，所述病毒为：负义单链RNA((-)ssRNA)病毒，正义单链RNA((+)ssRNA)病毒，双链RNA(dsRNA)病毒，或含DNA的病毒。7.如权利要求6所述的连续猪细胞系，其中，所述负义单链RNA((-)ssRNA)病毒为粘病毒，优选为正粘病毒科或副粘病毒科的病毒；所述正义单链RNA((+)ssRNA)病毒为黄病毒科、冠状病毒科或动脉炎病毒科的病毒；所述双链RNA(dsRNA)病毒为呼肠孤病毒科的病毒；或者所述含DNA的病毒为疱疹病毒科、圆环病毒科或Asfariviridae的病毒。8.如权利要求7所述的连续猪细胞系，其中，所述正粘病毒科的病毒选自于由甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、传染性鲑鱼贫血症病毒、Quaranjavirus和托高土病毒属所组成的组；所述副粘病毒科的病毒选自于由新城疫病毒、仙台病毒、麻疹病毒、亨德拉病毒和尼帕病毒所组成的组；所述黄病毒科的病毒选自于由黄病毒属、Pegivirus和瘟病毒属所组成的组；所述冠状病毒科的病毒为猪流行性腹泻病毒(PEDV)；所述动脉炎病毒科的病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)；所述呼肠孤病毒科的病毒为东南亚十二节段RNA病毒，所述东南亚十二节段RNA病毒选自于由版纳病毒(BAV)、Kadipiro病毒和辽宁病毒所组成的组；所述疱疹病毒科的病毒为猪疱疹病毒1型(SuHV1)；所述圆环病毒科的病毒为猪圆环病毒1型或猪圆环病毒2型(PCV-1或PCV-2)；或者所述Asfariviridae的病毒为非洲猪瘟病毒(ASFV)。9.如权利要求1-8中任一项所述的连续猪细胞系，其中，所述细胞系不需要外源蛋白酶来激活病毒感染性。10.如权利要求1-8中任一项所述的连续猪细胞系，其中，所述细胞系包含用于激活病毒感染性的内源性蛋白酶。11.如权利要求1-10中任一项所述的连续猪细胞系，其中，所述细胞系为PK-15S。12.如权利要求11所述的连续猪细胞系，其中，所述细胞系衍生自PK-15。13.如权利要求11或12所述的连续猪细胞系，其中，所述细胞系以保藏号DSMACC3307保藏于DSMZ。14.如权利要求1-10中任一项所述的连续猪细胞系，其中，所述细胞系为STS。15.如权利要求14所述的连续猪细胞系，其中，所述细胞系衍生自ST。16.如权利要求14或15所述的连续猪细胞系，其中，所述细胞系以保藏号DSMACC3308保藏于DSMZ。17.如权利要求1-16中任一项所述的连续猪细胞系，其中，所述细胞系未污染有来自其它细胞培养物的材料。18.如权利要求17所述的连续猪细胞系，其中，所述来自其它细胞培养物的材料包括猿猴细胞、犬细胞或其它猪细胞。19.一种生产病毒的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供连续猪细胞系，所述连续猪细胞系能够在不含动物来源成分的培养基中增殖，并且所述连续猪细胞系为容许所述病毒的细胞系，(ii)用所述病毒感染所述细胞系，或者用携带编码所述病毒的核酸序列的质粒转染所述细胞系，以及(iii)培养步骤(ii)中经感染的细胞系或经转染的细胞系，从而生产所述病毒。20.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：英戈·乔丹，福尔克·桑迪希，德博拉·霍恩，卡特琳·约翰，
申请(专利权)人：普罗拜奥根股份公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE