角膜上皮细胞群的制造方法技术

本发明专利技术提供一种制造角膜上皮细胞群的方法，该角膜上皮细胞群用于制作移植用角膜上皮细胞片，该方法包括：制备包含角膜上皮细胞的细胞群的工序(1)；将工序(1)中制备的细胞群供于磁性细胞分离，获得CD200阴性/SSEA‑4阳性细胞的工序(2)；及使工序(2)中获得的细胞与选自由具有α3链的层粘连蛋白、具有α4链的层粘连蛋白及具有α5链的层粘连蛋白组成的组中的层粘连蛋白或其E8片段接触，获得粘附细胞的工序(3)。

Manufacturing methods of corneal epithelial cell population

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】角膜上皮细胞群的制造方法
本专利技术涉及一种角膜上皮细胞群的制造方法，涉及一种用于移植用角膜上皮细胞片的制作的高纯度角膜上皮细胞群的制造方法。
技术介绍
角膜上皮细胞位于眼的最外层，起到对外界的防护功能等重要的功能。作为顽固的眼疾的一组，已知有作为角膜上皮干细胞缺损症的Stevens-Johnson综合症、眼类天疱疮、碱腐蚀等疾病。在角膜上皮干细胞缺损症中，因由外伤或自身免疫等造成的慢性炎症反应，存在于眼的角膜缘的角膜上皮干细胞陷入不可逆的功能不全、或消失，从而呈现角膜混浊的症状。作为其结果，眼的结膜上皮侵入角膜中央部，由此角膜失去本来所具有的透明性，导致显著的视力下降。作为用于恢复角膜上皮干细胞缺损症等严重的角膜疾病患者的视力的措施，一直以来施行角膜移植术。特别是对于双眼发病的双眼性的患者而言，现状是由于不存在来自患者本人的正常角膜，因此仅能够施行异体角膜移植术。然而，由于施行异体角膜移植术时，存在能够供给所需角膜的供体不足的问题、或存在对来自供体的角膜产生排斥反应的问题，因此期望开发使用自体细胞源的治疗法。作为针对角膜上皮干细胞缺损症等严重的角膜疾病的新型治疗法，本申请的专利技术人开发了由iPS细胞制作角膜上皮细胞片的技术，并使用动物模型确认了其有效性(非专利文献1)。由于通过非专利文献1中记载的分化诱导法、由iPS细胞生成的细胞为包括眼周围的各种细胞的细胞群，因此为了用于角膜上皮细胞片的制作，需要纯化角膜上皮细胞。因此，非专利文献1中，使用针对角膜上皮细胞特异性细胞表面标记的抗体，利用FACS分选进行纯化。FACS分选为利用液流使进行了抗体染色的细胞流动，通过激光的照射确认细胞表面抗原的表达并分拣特定的细胞的技术，但是难以保证细胞通过的全部流路的无菌性，存在可能有细胞污染的问题。并且，FACS分选存在回收后的细胞的损伤大的问题。进一步，FACS分选所使用的机器的维修需要专业的知识和技术。因此，在大量地制备用于移植用角膜上皮细胞片的制作的细胞的情况下，FACS分选不一定是理想的方法，将非专利文献1的技术实用化及产业化时仍留有技术问题。现有技术文献专利文献非专利文献1：Hayashietal.,Nature.2016Mar17；531(7594):376-80.doi:10.1038/nature17000.Epub2016Mar9.
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题本专利技术的技术问题在于，提供一种不使用FACS分选，通过短时间且简便的操作，由包含角膜上皮细胞的细胞群大量制造能够在移植用角膜上皮细胞片的制作中使用的高纯度且安全、损伤少的角膜上皮细胞群的方法。解决技术问题的技术手段为了解决上述的技术问题，本专利技术包括以下的专利技术。[1]一种制造用于制作移植用角膜上皮细胞片的角膜上皮细胞群的方法，其特征在于，其包括以下的工序(1)～(3)：(1)制备包含角膜上皮细胞的细胞群的工序；(2)将工序(1)中制备的细胞群供于磁性细胞分离，获得CD200阴性/SSEA-4阳性细胞的工序；及(3)使工序(2)中获得的细胞与选自由具有α3链的层粘连蛋白、具有α4链的层粘连蛋白及具有α5链的层粘连蛋白组成的组中的层粘连蛋白或其E8片段接触，获得粘附细胞的工序。[2]根据所述[1]所述的制造方法，其中，所述工序(3)为：(3-1)使工序(2)中获得的细胞与具有α2链的层粘连蛋白或其E8片段接触而获得非粘附细胞的工序；及(3-2)使得到的非粘附细胞与选自由具有α3链的层粘连蛋白、具有α4链的层粘连蛋白及具有α5链的层粘连蛋白组成的组中的层粘连蛋白或其E8片段接触，获得粘附细胞的工序。[3]根据所述[1]或[2]所述的制造方法，其中，所述包含角膜上皮细胞的细胞群为将多能干细胞分化诱导为眼周围细胞而得到的细胞群。[4]根据所述[1]～[3]中任一项所述的制造方法，其中，所述用于制作移植用角膜上皮细胞片的角膜上皮细胞群中的PAX6阳性/p63阳性细胞的比例为50％以上。[5]根据所述[1]～[4]中任一项所述的制造方法，其中，选自由具有α3链的层粘连蛋白、具有α4链的层粘连蛋白及具有α5链的层粘连蛋白组成的组中的层粘连蛋白或其E8片段为层粘连蛋白α3β3γ2的E8片段、层粘连蛋白α4β1γ1的E8片段或层粘连蛋白α5β1γ1的E8片段。[6]根据所述[2]所述的制造方法，其中，具有α2链的层粘连蛋白或其E8片段为层粘连蛋白α2β1γ1的E8片段。[7]一种移植用角膜上皮细胞片的制造方法，其特征在于，其包括对通过所述[1]～[6]中任一项所述的制造方法制造的角膜上皮细胞群进行培养的工序。专利技术效果根据本专利技术，能够不使用FACS分选，通过短时间且简便的操作，由包含角膜上皮细胞的细胞群大量地制造能够在移植用角膜上皮细胞片的制作中使用的高纯度且安全、损伤少的角膜上皮细胞群。附图说明图1为示出通过FACS分选对由iPS细胞分化诱导的眼周围细胞中的CD200阴性/SSEA-4阳性/ITGB4阳性细胞进行分离的结果的图，为(A)表示CD200阴性细胞的区域、(B)表示CD200阴性/SSEA-4阳性/ITGB4阳性细胞的区域的图。图2为示出将通过FACS分选分离的CD200阴性/SSEA-4阳性/ITGB4阳性细胞培养3周的结果的图，为(A)表示利用相差显微镜观察细胞的结果、(B)表示对得到的细胞片的表达蛋白进行分析的结果的图。图3为示出针对由iPS细胞分化诱导的眼周围细胞、通过磁性细胞分离从该眼周围细胞中去除CD200阳性细胞而成的细胞以及通过磁性细胞分离分拣了SSEA-4阳性细胞的细胞，通过FACS分别对CD200、SSEA-4及ITGB4的表达进行分析的结果的图。图4为将图3的FACS分析结果制成图表的图。图5为示出将由iPS细胞分化诱导的眼周围细胞接种于涂布有各种层粘连蛋白E8片段的板，分别回收非粘附细胞，通过FACS对CD200、SSEA-4及ITGB4的表达进行分析的结果的图。图6为示出将由iPS细胞分化诱导的眼周围细胞接种于涂布有层粘连蛋白211-E8片段的板，并对非粘附细胞的角膜上皮细胞率进行分析的结果的图。图7为示出将由iPS细胞分化诱导的眼周围细胞接种于涂布有层粘连蛋白211-E8片段的板，并对粘附细胞的角膜上皮标记基因及非角膜上皮标记基因的表达进行分析的结果的图。图8为示出使用由iPS细胞分化诱导的眼周围细胞，在通过本专利技术的制造方法制造角膜上皮细胞群的过程中，对各阶段的细胞群的角膜上皮标记基因及非角膜上皮标记基因的表达进行分析的结果的图。图9为示出将通过本专利技术的制造方法制造的角膜上皮细胞群在层粘连蛋白511-E8片段上培养3周，并用相差显微镜观察成为融合(confluent)状态的细胞的结果的图。图10为示出将通过本专利技术的制造方法制造的角膜上皮细胞群在层粘连蛋白511-E8片段上培养3周，并对得到的细胞片的表达蛋白进行分析的结果的图。图11为示出将通过本专利技术的制造方法制造的角膜上皮细胞群及通过FACS分选分离的CD200阴性/SSEA-4阳性/ITGB4阳性细胞分别在层粘连蛋白511-E8片段上培养3周后，剥离并分散细胞，通过FACS对K14阳性细胞及K12阳性细胞进行分析的结果的图。图12为示出将由通过本专利技术的制造方法制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制造用于制作移植用角膜上皮细胞片的角膜上皮细胞群的方法，其特征在于，其包括以下的工序(1)～(3)：(1)制备包含角膜上皮细胞的细胞群的工序；(2)将工序(1)中制备的细胞群供于磁性细胞分离，获得CD200阴性/SSEA‑4阳性细胞的工序；及(3)使工序(2)中获得的细胞与选自由具有α3链的层粘连蛋白、具有α4链的层粘连蛋白及具有α5链的层粘连蛋白组成的组中的层粘连蛋白或其E8片段接触，获得粘附细胞的工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.01.13 JP 2017-0044191.一种制造用于制作移植用角膜上皮细胞片的角膜上皮细胞群的方法，其特征在于，其包括以下的工序(1)～(3)：(1)制备包含角膜上皮细胞的细胞群的工序；(2)将工序(1)中制备的细胞群供于磁性细胞分离，获得CD200阴性/SSEA-4阳性细胞的工序；及(3)使工序(2)中获得的细胞与选自由具有α3链的层粘连蛋白、具有α4链的层粘连蛋白及具有α5链的层粘连蛋白组成的组中的层粘连蛋白或其E8片段接触，获得粘附细胞的工序。2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述工序(3)为：(3-1)使工序(2)中获得的细胞与具有α2链的层粘连蛋白或其E8片段接触而获得非粘附细胞的工序；及(3-2)使得到的非粘附细胞与选自由具有α3链的层粘连蛋白、具有α4链的层粘连蛋白及具有α5链的层粘连蛋白组成的组中的层粘连蛋白或其E8片...

【专利技术属性】
技术研发人员：西田幸二，林龙平，柴田峻，
申请(专利权)人：国立大学法人大阪大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP