三维体外肺泡肺模型、所述模型的制备方法以及其用于确定和/或预测可吸入物的致敏效果的用途技术

技术编号:21958592 阅读:26 留言:0更新日期:2019-08-24 21:55
本发明专利技术涉及一种三维体外肺泡肺模型,其基本上包括如下四种细胞类型:能够分泌(肺部铺设)表面活性物质的肺泡II型上皮细胞,构成提供渗透性屏障的毛细血管内衬层的内皮细胞,树突状细胞(如未分化的THP‑1,连接先天性和适应性免疫),以及巨噬细胞样细胞,能够通过吞噬作用摄入外来物质参与防御机制。本发明专利技术还涉及制备所述模型的方法,及其用于评估可吸入物诸如颗粒或分子对肺的肺泡屏障的刺激潜力或毒性,以及用于确定和/或预测可吸入物诸如颗粒或分子对肺的肺泡屏障的致敏效果的用途。

Three-dimensional in vitro alveolar-pulmonary model, preparation method of the model and its application in determining and/or predicting the sensitization effect of inhalants

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】三维体外肺泡肺模型、所述模型的制备方法以及其用于确定和/或预测可吸入物的致敏效果的用途
本专利技术涉及一种三维体外肺泡肺模型及所述模型的制备方法。本专利技术还涉及其用于评估可吸入物(诸如可吸入颗粒或分子)对肺的肺泡屏障的刺激潜力或毒性,以及用于确定和/或预测可吸入物(诸如可吸入颗粒或分子)对肺的肺泡屏障的致敏效果的用途和方法。
技术介绍
由于接触化学产品而引起的呼吸道致敏在过去几十年中增加,导致发病率的增加。例如香料和工业溶剂之类的合成化合物的更广泛使用,导致我们每天可能接触到的物质呈指数增长。已知这些物质中的一些会引起呼吸道致敏,这意味着它们会随着时间的推移引发过敏反应的发展,并可能产生不良的全身性反应。这可能导致呼吸系统疾病,如哮喘、过敏性鼻炎、鼻结膜炎和鼻窦炎。为了表征这些化学物质的潜在风险,有必要充分了解肺致敏中所涉及的机制。在过去,动物研究为了解呼吸道过敏发生中涉及的机制提供了有用的结果。然而,对所涉及的细胞效应的机制理解仍然是有限的。已经提出了几种方法来区分和鉴定过敏原的功能和结构特征,但这些研究都没有得出决定性的结果,这主要是由于生物源和环境混杂的辅助因素。这种知识的缺乏阻碍了预测性体外模型的发展,使体内模型成为表征呼吸道过敏原的唯一工具。然而,尽管缺乏确定和表征呼吸道致敏物的有效方法,但诸如REACH(化学品的注册、评估、授权和限制)的法规要求并鼓励使用非动物方法进行毒理学评估。目前,还没有一种经过验证的体外方法,可以作为体内测试的替代方法,并能够识别和表征作为呼吸道致敏物的化学物质的潜力。在2013年的出版物(Klein等,微粒和纤维毒理学报,2013,10:31)中,作者提出了由肺泡II型上皮细胞系(A459)、分化巨噬细胞样细胞(THP-1)、肥大细胞(HMC-1)和内皮细胞(EA.hy926)组成的四培养物(tetraculture)模型,这使得模型能够暴露于气-液界面(ALI)。然而,观察到细胞在浸没条件下形成异质菌落:这导致过高估计在例如ROS(活性氧类)产生和IL-8分泌的结果中观察到的效果。此外,Klein的模型由于缺乏相关的感受态细胞而不能用于致敏作用的评价,且由于孔径尺寸减小而不允许细胞通过膜迁移。与培养箱对照相比,ALI处的暴露对培养物具有引发效应,其呈现更高的基础氧化应激水平。这对于提供毒理学效应更现实估计的外部挑战给出一个更生理学的答案。此外,ALI处的暴露允许对于外源性化合物的现实接触,无需在包含许多会与研究中的化学物质相互作用的生物分子的细胞培养基中的前稀释,由此可能改变生物效应的读数,导致不可预知的低估或高估的生物效应。迄今为止提出的用于呼吸毒理学的所有先前模型通常使用支气管细胞系制成,与呼吸道致敏的背景无关。因此,需要一个相关的工具来研究呼吸道致敏并预测可吸入化学物质和小颗粒的呼吸潜力。专利技术目的本专利技术的第一个目的是提供一种模拟肺的肺泡表面的体外模型,以评估可吸入物、化学物质以及颗粒的呼吸道致敏潜力。
技术实现思路
本专利技术涉及一种三维体外肺泡肺模型,主要包括以下四种细胞类型:a)能够分泌(肺部铺设)表面活性物质的肺泡II型上皮细胞,b)构成提供渗透性屏障的毛细血管内衬层的内皮细胞,c)树突状细胞(连接先天性和适应性免疫),d)巨噬细胞样细胞,能够通过吞噬作用摄入外来物质,从而参与防御机制,其中:所述三维体外肺泡肺模型是培养孔的形式,所述培养孔配备有多孔膜,该多孔膜将孔分成暴露于气-液界面的顶部隔室,以及浸没在培养基中的基底侧隔室,所述上皮细胞和所述巨噬细胞存在于顶部隔室中,且所述内皮细胞和所述树突状细胞存在于基底侧隔室并浸入在培养基中,所述多孔膜具有2μm至10μm的孔,以使树突状细胞能够从基底侧隔室迁移至顶端隔室。这里所说的“主要”是指所述肺泡肺模型实质上包括上述四种细胞类型,特别是所述肺泡肺模型不包括肥大细胞,其可能导致错误的结果。所说的“实质上”,特别是指所述模型不包括肥大细胞,其可能在可吸入物的毒性或致敏作用的评估中导致错误的结果。专利技术详述更具体而言,巨噬细胞样细胞是用PMA(佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯)或1,25-二羟基维生素D3分化的THP-1细胞,优选用PMA分化。这种分化最好在几天内完成:有利地是3到10天,优选5天。在本专利技术的模型中,所有细胞均为永生化哺乳动物细胞系,该细胞系是比原代细胞更为稳定的细胞,并且优选为永生化人类细胞系。“优选地”,所述肺泡II型上皮细胞为A549细胞。且“优选地”,所述内皮细胞为EA.hy926细胞。而且“优选地”,所述树突状细胞是未分化的THP-1细胞,其为人类树突细胞的孔建立模型。树突细胞在致敏过程中至关重要,因为这些细胞负责识别和捕获抗原,从而触发免疫应答。有利地,本专利技术的三维体外肺泡肺模型包括:a)A549细胞,作为肺泡II型上皮细胞,b)EA.hy926细胞,作为内皮细胞,c)未分化的THP-1细胞,作为树突状细胞,d)用PMA分化的THP-1细胞,作为巨噬细胞样细胞,且不包括肥大细胞。在本专利技术的一个优选实施方案中,本专利技术的三维体外肺泡肺模型仅由以下四培养物组成:a)A549细胞,作为肺泡II型上皮细胞,b)EA.hy926细胞,作为内皮细胞,c)未分化的THP-1细胞,作为树突状细胞,d)由PMA分化的THP-1细胞,作为巨噬细胞样细胞。与Klein2013年的四培养物模型相比,本模型剔除了肥大细胞,肥大细胞可以改变局部微环境,影响树突状细胞的应答。因此,本模型更精确地模拟了体内情况,其中肥大细胞只存在于过敏性炎症的阶段(诱发阶段),而不存在于过敏性炎症之前的致敏阶段。肥大细胞对各种生物刺激都有应答,其中最重要的是通过B淋巴细胞释放免疫球蛋白E(IgE)。由于B淋巴细胞不存在于本专利技术模型中,而且HMC-1细胞也不存在IgE的功能受体,因此在本模型中加入肥大细胞只会增加不必要的复杂性,不会带来任何额外的价值。分开顶部隔室和基底侧隔室的多孔膜可以是例如插入物的一部分。有利地,多孔膜具有3μm至8μm,更优选4μm至6μm的孔。在Klein的模型中,四培养物中不存在树突细胞,当然,顶部隔室中也不存在树突细胞。Klein模型中树突细胞的缺失使得该模型无法预测呼吸道致敏。树突细胞在致敏过程的诱导阶段起着关键作用,如果没有树突细胞,整个过程就无法研究。树突状细胞从基底侧隔室迁移到顶部隔室的能力也是该模型的一个重要特征(这在Klein的模型中是不可能的)。树突细胞不是天然地不存在于肺泡中的,它们只是在外源性刺激的作用下才被吸收到肺泡中。此外,为了真实地估计致敏潜力,重要的是,树突状细胞不直接暴露于致敏物,致敏物应首先与上皮细胞和驻留的巨噬细胞接触。由于上皮细胞或巨噬细胞的代谢过程,这种接触可能增强或降低吸入物质的致敏潜力。本专利技术还涉及一种制备上述三维体外肺泡肺模型的方法,包括在具有多孔膜的插入物中共培养细胞a)至d),步骤顺序如下:i)在具有2μm至10μm孔的膜插入物的下表面(其将成为基底侧)接种0.24105至0.6105内皮细胞/cm2,ii)至少4小时后,在膜插入物的另一侧(顶侧)接种肺泡II型上皮细胞,优选0.12105至1.2105,优选0.5105至1.0105细胞/cm2,iii)本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种三维体外肺泡肺模型,主要包括以下四种细胞类型:a)能够分泌表面活性物质的肺泡II型上皮细胞,b)构成提供渗透性屏障的毛细血管内衬层的内皮细胞,c)树突状细胞,d)巨噬细胞样细胞,能够通过吞噬作用摄入外来物质,从而参与防御机制,其中:所述三维体外肺泡肺模型是培养孔的形式,所述培养孔配备有多孔膜,该多孔膜将孔分成暴露于气‑液界面的顶部隔室,以及浸没在培养基中的基底侧隔室,所述上皮细胞和所述巨噬细胞存在于顶部隔室中,且所述内皮细胞和所述树突状细胞存在于基底侧隔室并浸入在培养基中,所述多孔膜具有2μm至10μm的孔,以使树突状细胞能够从基底侧隔室迁移至顶部隔室。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.27 LU 934011.一种三维体外肺泡肺模型,主要包括以下四种细胞类型:a)能够分泌表面活性物质的肺泡II型上皮细胞,b)构成提供渗透性屏障的毛细血管内衬层的内皮细胞,c)树突状细胞,d)巨噬细胞样细胞,能够通过吞噬作用摄入外来物质,从而参与防御机制,其中:所述三维体外肺泡肺模型是培养孔的形式,所述培养孔配备有多孔膜,该多孔膜将孔分成暴露于气-液界面的顶部隔室,以及浸没在培养基中的基底侧隔室,所述上皮细胞和所述巨噬细胞存在于顶部隔室中,且所述内皮细胞和所述树突状细胞存在于基底侧隔室并浸入在培养基中,所述多孔膜具有2μm至10μm的孔,以使树突状细胞能够从基底侧隔室迁移至顶部隔室。2.根据权利要求1所述的模型,其中所述巨噬细胞样细胞是用PMA(佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯)或1,25-二羟基维生素D3分化的THP-1细胞,优选用PMA分化。3.根据权利要求1和2中任一项所述的模型,其中所有细胞均为永生化人类细胞系。4.根据前述权利要求中任一项所述的模型,其中所述肺泡II型上皮细胞是A549细胞。5.根据前述权利要求中任一项所述的模型,其中所述内皮细胞是EA.hy926细胞。6.根据前述权利要求中任一项所述的模型,其中所述树突状细胞是未分化的THP-1细胞。7.根据权利要求1至6中任一项所述的模型,其中所述多孔膜具有3μm至8μm的孔。8.根据前述权利要求中任一项所限定的三维体外肺泡肺模型的制备方法,包括在具有多孔膜的插入物中共培养细胞a)-d),步骤顺序如下:i)在具有2μm至10μm的孔的膜插入物的下表面(其将成为基底侧)接种0.24105至0.6105内皮细胞/cm2,ii)至少4小时后,在膜插入物的另一侧(顶部侧)接种肺泡II型上皮细胞,优选0.12105至1.2105,优选0.5105至1.0105细胞/cm2,iii)约4天后,在膜插入物的基底侧加入含有10-100万个树突状细胞/mL的细胞悬液,然后iv)在肺泡II型上皮细胞孢子上添加巨噬细胞样细胞,优选0.121...

【专利技术属性】
技术研发人员:阿林·沙里阿尔诺·古特莱贝托马索·塞尔基布伦海尔德·布洛梅克
申请(专利权)人:卢森堡理工学院
类型:发明
国别省市:卢森堡,LU

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