生物打印的毛囊及其用途制造技术

公开了包含细胞构建体的组合物，所述细胞构建体包含间充质细胞和上皮细胞。还公开了制备细胞构建体的方法、毛发修复的方法和试剂盒。本发明专利技术还公开了并行生物打印系统和用于制备细胞构建体，诸如包含间充质细胞和上皮细胞的细胞构建体的方法。

Bioprinting follicles and their applications

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物打印的毛囊及其用途专利技术背景专利
本专利技术属于毛发移植组合物及方法的领域。特别地，本专利技术提供了包含细胞构建体的组合物，所述细胞构建体包含间充质细胞和上皮细胞。本专利技术还提供了制备细胞构建体的方法、毛发修复的方法及试剂盒。本专利技术还公开了并行生物打印系统及用于使用并行生物打印系统制备细胞构建体，诸如包含间充质细胞和上皮细胞的细胞构建体的方法。
技术介绍
现代毛发移植开始于20世纪50年代，当时使用4-mm打孔器采集毛囊。打孔器尺寸逐渐减小，以提高移植物存活并使移植的毛发看起来更自然。随后，在20世纪90年代早期，显微移植——使用大量的用多刃刀采集的小移植物——成为毛发移植的标准。随后，打孔器采集被放弃，而转向供体条带切除术(donorstripexcision)，以使产量最大化并使对供体毛囊的损伤最小化。单一条带采集的一个显著缺点是造成供体疤痕。这种疤痕在选择将其头发留得非常短的患者中或在愈合疤痕扩大的患者中造成美容问题。在具有非常紧的头皮、其中直接缝合(primaryclosure)困难的患者中，单一条带采集有时是有问题的。参见Rassman等人，Dermatol.Surg.28:720-727(2002)。为了克服毛囊单一条带采集的缺点，Rassman等人(2002)开发了毛囊单位提取(FUE)，其中通过非常小的打孔器切口从供体直接取出单独的毛囊单位(FU)。FUE存在许多明显的缺点，包括(1)供体区域损伤(与传统条带采集相比，FU的切除涉及切口总长度的大幅增加)，(2)美容因素(在准备进行FUE时，必须将大面积的供体区域剪短，以便找到适合于提取的大量FU，造成“显著的术后美容问题”)，(3)毛囊损伤(FU受损比预期用传统采集更多)，(4)毛囊方向扭曲(当小的供体部位愈合时，它们产生了扭曲毛发方向或相邻FU的角度的疤痕)，(5)感染风险增加(如果另外的FUE程序间隔一天或数天进行以避免毛囊方向的扭曲，则几乎确定存在在供体区域出现细菌病原体的更大的可能性)，以及(6)操作时间增加(FUE远比传统采集更耗时)。参见Unger,W.,"Commentary,"Dermatol.Surg.28:727-728(2002)。FUE的一个替代方案是人类毛囊的从头工程化。过去二十至三十年中的工作已经将毛发形成中涉及的关键细胞缩小到间充质细胞群体，包括真皮乳头细胞和置于上层的(overlying)上皮角质细胞。随后的工作确立了，真皮乳头细胞是诱导角质细胞形成毛鞘和毛干严格需要的。最初的重建实验是用啮齿动物细胞进行的，但在测试可比性的人类细胞时，并未立即转化为成功的毛发生长。这突出了在毛发形成方面的物种特异性差异。已经发现，将人类真皮乳头细胞聚集成3D球状体部分地恢复了细胞内完整的真皮乳头基因表达特征，并且进而恢复了其相关的毛发诱导特性。认为球状体培养的使用是必要的，但是七个细胞系中的两个不能促进受体皮肤中的毛发新生(neohair)，并且确实生长的毛囊小且通常不能产生长出皮肤表面的毛发纤维。Higgins等人，PNAS110:19679-88(2013)。因此，在本领域存在对克服现有缺点的从头生成毛囊的新方法的需要。本专利技术克服了这些缺点，并为移植及治疗脱发提供了近乎无限供应的FU。本专利技术还提供了一种并行生物打印系统以及使用该并行生物打印系统来制备细胞构建体的相应方法。不同于被打印后就基本上固定的传统的三维打印材料，诸如热塑性塑料，生物墨水(bioink)可以具有流体动力学性质，并因此在生物打印后具有流动的趋势。解决生物墨水的动力学性质的一种方法是生物打印到支撑材料，诸如半固体材料中。支撑材料可以限制生物打印的生物墨水的流动。结果是，在生物打印后通常缺乏完整性来保持其形状的薄垂直结构可以变得可能。然而，当两种材料，诸如两种单独的生物墨水，必须区别地生物打印，诸如以连续或平行形式的邻接线段打印时，这种方法存在技术问题。例如，第二分配器的运动和/或所分配的第二生物墨水可以直接干扰或者通过干扰支撑材料间接干扰由第一分配器分配的第一生物墨水。因此，这个技术问题的一个解决方案是开发一种具有平行分配系统的生物打印机，所述平行分配系统具有带有两个分配尖端的共同出口，其中所述两个分配尖端基本上平行。即使当在不具有支撑材料的平坦表面上进行生物打印时，用邻接的两种单独的生物墨水产生几何形状的能力也可能被各自的生物墨水的流动行为损害。如果第一分配的生物墨水流到第二分配的生物墨水的目标区域中，则所实现的生物打印结构可能大幅偏离。这个技术问题通过本专利技术的并行生物打印系统及相应的方法来解决，因为它们能够从基本上平行的两个单独的分配尖端沉积两种单独的生物墨水。这通过解决前述与生物墨水的流变特性相关的复杂性促进了多种单独的生物墨水的差异沉积和/或图案化。具体地，本专利技术允许在第一生物墨水的沉积后流动损害所述图案之前，和/或通过将支撑材料内的运动限制到能够沉积两种或更多种不同的生物墨水的一个单独的分配器，来沉积多种单独的生物墨水，以实现期望的图案。另一个重要的技术挑战是生物墨水的流体动力学。流体阻力随流体路径长度而增加。由于生物墨水的生物材料组成成分的价值，理想地应当使死体积最小化。死体积可以通过使流体通道的直径最小化来最小化。流体阻力随流体通道的直径减小而增加。生物墨水在性质上通常是非牛顿流体，意味着它们的粘度不是恒定的，而是随施加的力而变化。这种可变的粘度增加了生物打印过程的复杂性，使生物墨水的受控的分配成为一项技术挑战。因此，固有的高流体阻力加上生物墨水的非牛顿流体特性造成复杂性。具体地，材料开始和/或停止流出分配器的时间分别不同于将力施加到分配器和/或从分配器解除的时间。这直接抑制了分配器实现其促进多种单独的生物墨水的高分辨率、差异图案化的目的。例如，如果当第二生物墨水开始流出第二分配尖端时，第一生物墨水仍在从第一分配尖端流出，则所实现的结构将偏离所期望的结构。本文描述的并行生物打印系统和方法的目的是，通过解决前述与生物墨水流变特性相关的技术挑战，来促进多种单独的生物墨水的差异化沉积和/或图案化。具体地，本专利技术允许在材料的沉积后流动损害所述图案之前，以及通过将支撑材料内的运动限制到能够沉积两种或更多种不同的生物墨水的一个单独的分配器，来同时沉积多种单独的生物墨水，以实现期望的结构和/或图案。为了解决如上所述的与生物墨水的流体动力学相关的技术挑战，所公开的并行生物打印系统能够施加相反的力，诸如抽吸步骤，以阻止生物材料，诸如生物墨水流动。此外，所公开的并行生物打印系统能够将时间控制(temporalcontrol)返回到并行生物打印系统，并允许随后的生物墨水不受第一分配的生物墨水不利影响地沉积。专利技术概述本专利技术提供了包含水凝胶的组合物，所述水凝胶包含多于一个通道，所述通道包含细胞构建体，所述细胞构建体包含间充质细胞和上皮细胞。在一个实施方案中，水凝胶是胶原、变性胶原、明胶、透明质酸或其盐、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖或其组合。在某些实施方案中，水凝胶、细胞构建体和/或通道还包含至少一种另外的细胞类型。在其他实施方案中，水凝胶、细胞构建体和/或通道中的所述至少一种另外的细胞类型是皮肤成纤维细胞、内皮细胞、前脂肪细胞、免疫细胞、黑素细胞或干本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，所述组合物包含含有多于一个通道的水凝胶，所述通道包含细胞构建体，所述细胞构建体包含间充质细胞和上皮细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.10 US 62/420,4891.一种组合物，所述组合物包含含有多于一个通道的水凝胶，所述通道包含细胞构建体，所述细胞构建体包含间充质细胞和上皮细胞。2.如权利要求1所述的组合物，其中所述水凝胶、细胞构建体和/或所述通道还包含至少一种另外的细胞类型。3.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述水凝胶、细胞构建体和/或通道中的所述至少一种另外的细胞类型是皮肤成纤维细胞、内皮细胞、前脂肪细胞、免疫细胞、黑素细胞或干细胞。4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述水凝胶、细胞构建体和/或所述通道包含至少一种毛囊成熟因子。5.如权利要求4所述的组合物，其中所述至少一种毛囊成熟因子是成纤维细胞生长因子(FGF)、Wnt激动剂或其组合。6.如权利要求5所述的组合物，其中所述FGF是FGF5、FGF7、FGF9、FG10或其组合。7.如权利要求5所述的组合物，其中所述Wnt激动剂是CHIR99021、LiCl、SB-216763或CAS853220-52-7。8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述细胞构建体还包含黑素细胞。9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述细胞构建体是基本上直的。10.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述细胞构建体是弯曲的。11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述细胞构建体的表面是不规则的。12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述间充质细胞被分段在所述细胞构建体的一端，并且所述上皮细胞被分段在所述细胞构建体的另一端。13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述细胞构建体的长度为50μm至10,000μm，并且直径为50μm至2000μm。14.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述细胞构建体的长度为4mm至10mm，并且直径为50μm至750μm。15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中间充质细胞与上皮细胞的比为10:1至1:10。16.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中间充质细胞与上皮细胞的比为1:2至1:1。17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述间充质细胞是真皮乳头细胞。18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述细胞构建体还包含囊。19.如权利要求18所述的组合物，其中所述囊包含真皮乳头细胞。20.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述上皮细胞是皮肤上皮细胞。21.如权利要求20所述的组合物，其中所述皮肤上皮细胞是角质细胞。22.如权利要求1-21中任一项所述的组合物，其中所述间充质细胞和上皮细胞是人类细胞。23.如权利要求1-22中任一项所述的组合物，其中所述水凝胶包含胶原、透明质酸或其盐、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖或其组合。24.如权利要求23所述的组合物，其中所述水凝胶包含藻酸盐。25.如权利要求1-24中任一项所述的组合物，其中所述水凝胶是交联的。26.一种试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1-25中任一项所述的组合物以及使用所述试剂盒的说明书。27.如权利要求26所述的试剂盒，还包括植入所述细胞构建体的仪器。28.一种制备如权利要求1-25中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括将所述间充质细胞和上皮细胞沉积到所述水凝胶中。29.如权利要求28所述的方法，其中通过将针插到所述水凝胶中，并在收回所述针的同时，从所述针的尖端挤出所述间充质细胞和上皮细胞，而将所述间充质细胞和上皮细胞的混合物沉积到所述水凝胶中。30.如权利要求29所述的方法，其中通过将一根或更多根针插到所述水凝胶中，并在收回所述针的同时，从所述针的尖端挤出所述间充质细胞和上皮细胞，而将所述间充质细胞和上皮细胞沉积到所述水凝胶中。31.如权利要求30所述的方法，其中所述间充质细胞被分段在所述针的尖端。32.如权利要求31所述的方法，其中所述间充质细胞从所述针的尖端沉积，并且然后所述上皮细胞从所述针沉积，以提供分段的细胞构建体，所述分段的细胞构建体具有在所述通道的底部末端处的所述间充质细胞和在所述通道的顶部末端处的所述上皮细胞。33.如权利要求32所述的方法，其中先用上皮细胞装载所述针，然后用间充质细胞在所述针的尖端装载所述针，然后沉积所述细胞。34.如权利要求30所述的方法，其中所述针是具有两个或更多个分隔的材料路径的同轴装置，所述材料路径为至少两种不同类型的细胞提供围绕至少两种不同输入物的共同轴的同心流动，其中所述间充质细胞从所述同轴针的芯挤出，并且所述上皮细胞从所述同轴针的套层挤出。35.如权利要求34所述的方法，其中所述间充质细胞从所述针的芯沉积，并且然后所述上皮细胞从所述同轴针的套层沉积，以提供分段的细胞构建体，所述分段的细胞构建体具有在所述通道的底端处的所述间充质细胞和在所述通道的顶端处的所述上皮细胞。36.如权利要求28-35中任一项所述的方法，其中所述间充质细胞和上皮细胞作为还包含挤出化合物的一种或更多种组合物的一部分来沉积。37.如权利要求36所述的方法，其中所述挤出化合物包括藻酸盐、水凝胶、胶原、细胞外基质组分、或水溶性、可交联、生物可降解的聚合物。38.如权利要求28-37中任一项所述的方法，还包括使所述细胞构建体成熟。39.如权利要求38所述的方法，其中使所述细胞构建体成熟1至42天。40.如权利要求38所述的方法，其中使所述细胞构建体成熟7至21天。41.如权利要求28-40中任一项所述的方法，还包括从所述水凝胶中取出所述细胞构建体。42.如权利要求28-41中任一项所述的方法，其中所述沉积由自动化装置控制，所述自动化装置包括至少一根针和与所述针流体连通的一个或更多个储存器，以及用于挤出所述至少一根针的内容物的工具，其中所述一个或更多个储存器包括间充质细胞、上皮细胞或其混合物、以及将所述针相对于所述水凝胶的表面定位的致动工具。43.如权利要求42所述的方法，其中所述自动化装置将多于一个构建体沉积在所述水凝胶中。44.如权利要求42或权利要求43所述的方法，其中所述自动化装置包括计算机处理器，所述计算机处理器被通信地连接到用于挤出所述至少一根针的所述内容物的工具。45.如权利要求28-44中任一项所述的方法，其中所述间充质细胞和上皮细胞是人类细胞。46.如权利要求28-45中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞不沉积为球状体。47.如权利要求28-46中任一项所述的方法，其中所述针是有斜面的。48.如权利要求47所述的方法，其中所述针的斜面为10度至45度。49.如权利要求47所述的方法，其中所述针的斜面为约30度。50.如权利要求28-49中任一项所述的方法，其中所述针的内径为150μm至1000μm。51.如权利要求50所述的方法，其中所述针的外径为约250μm至约1250μm。52.如权利要求28-51中任一项所述的方法，其中所述水凝胶是交联的。53.一种细胞构建体，所述细胞构建体呈包含间充质细胞和上皮细胞的柱的形式。54.如权利要求53所述的细胞构建体，还包含黑素细胞。55.如权利要求53或权利要求54所述的细胞构建体，其中所述细胞构建体是基本上直的。56.如权利要求54或权利要求54所述的细胞构建体，其中所述细胞构建体是弯曲的。57.如权利要求53-54中任一项所述的细胞构建体，其中所述细胞构建体的表面是不规则的。58.如权利要求53-57中任一项所述的细胞构建体，其中所述间充质细胞被分段在所述细胞构建体的一端，并且所述上皮细胞被分段在所述细胞构建体的另一端。59.如权利要求53-58中任一项所述的细胞构建体，其中所述细胞构建体的长度为50μm至10,000μm，并且直径为50μm至2000μm。60.如权利要求53-59中任一项所述的细胞构建体，其中所述细胞构建体的长度为4mm至10mm，并且直径为50μm至750μm。61.如权利要求53-60中任一项所述的细胞构建体，其中间充质细胞与上皮细胞的比为10:1至1:10。62.如权利要求53-61中任一项所述的细胞构建体，其中间充质细胞与上皮细胞的比为1:2至1:1。63.如权利要求53-62中任一项所述的细胞构建体，其中所述间充质细胞是真皮乳头细胞。64.如权利要求53-63中任一项所述的细胞构建体，其中所述细胞构建体还包含囊。65.如权利要求64所述的细胞构建体，其中所述囊包含真皮乳头细胞。66.如权利要求53-65中任一项所述的细胞构建体，其中所述上皮细胞是皮肤上皮细胞。67.如权利要求66所述的细胞构建体，其中所述皮肤上皮细胞是角质细胞。68.如权利要求53-67中任一项所述的方法，其中所述间充质细胞和上皮细胞是人类细胞。69.一种修复个体中的毛发的方法，所述方法包括将至少一种如权利要求53-68中任一项所述的细胞构建体植入到所述个体的皮肤中。70.如权利要求69所述的方法，其中所述皮肤是头皮。71.如权利要求69或70所述的方法，其中所述植入是手动的。72.如权利要求69或70所述的方法，其中所述植入是自动化的。73.一种修复个体中的毛发的方法，所述方法包括将包含间充质细胞和上皮细胞的组合物植入到所述个体的皮肤中。74.如权利要求73所述的方法，其中所述组合物通过将针插到所述皮肤中来植入。75.如权利要求73所述的方法，其中所述针是具有两个或更多个分隔的材料路径的同轴装置，所述材料路径为至少两种不同类型的细胞提供围绕至少两种不同输入物的共同轴的同心流动，其中所述间充质细胞从所述同轴针的芯挤出，并且所述上皮细胞从所述同轴针的套层挤出。76.如权利要求73-75中任一项所述的方法，其中所述皮肤是...

【专利技术属性】
技术研发人员：艾米莉·博泽克，乔纳·库尔，哈利·S·拉波博特，克里斯蒂安·霍尔姆斯，史蒂芬·L·潘托尼，切德·维尔格尔，霍华德·黄，克里斯多佛·肖，
申请(专利权)人：奥加诺沃公司，
类型：发明
国别省市：美国,US