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提高嵌合抗原受体T细胞疗效和作用持久性的细胞培养方法技术

技术编号:21942262 阅读:28 留言:0更新日期:2019-08-24 14:23
本发明专利技术提供一种提高嵌合抗原受体T细胞疗效和作用持久性的细胞培养方法,通过添加络氨酸激酶抑制剂达沙替尼(dasatinib)减少CAR‑T细胞活化信号传递,抑制了CAR‑T细胞的终末分化,提高了CAR‑T细胞制品中的初始T细胞和中心记忆T细胞的比例,同时抑制CAR‑T细胞的耗竭倾向。本发明专利技术方法解决了体外培养过程中CAR‑T细胞的终末分化和耗竭倾向的难题。本发明专利技术方法培养过程简单易行,成本低廉,临床应用安全可靠;培养得到的CAR‑T细胞初始T细胞和中心记忆T细胞比例高,并避免了CAR‑T细胞的耗竭倾向,重复性好;培养得到的CAR‑T细胞展现出更好的治疗疗效和体内维持持久性,具有广泛的应用推广价值。

Cell Culture Method for Improving the Efficacy and Durability of Chimeric Antigen Receptor T Cells

【技术实现步骤摘要】
提高嵌合抗原受体T细胞疗效和作用持久性的细胞培养方法
本专利技术属于免疫学和细胞治疗研究领域,涉及一种提高嵌合抗原受体T细胞疗效和作用持久性的细胞培养方法,是应用络氨酸激酶抑制药物提高CAR-T细胞中初始T细胞和中心记忆T细胞,减少CAR-T细胞耗竭的培养方法。
技术介绍
嵌合抗原受体T(chimericantigenreceptormodifiedT,CAR-T)细胞免疫疗法近年成为免疫靶向治疗中最具发展前途的一种治疗手段,其作用原理是利用基因工程技术,将能识别某种肿瘤抗原的特异性单链单克隆抗体的抗原结合部与T细胞受体的酪氨酸活化基序及共刺激分子在体外偶联为一个嵌合蛋白,通过病毒载体等方法转染T细胞,使T细胞能够特异性识别肿瘤细胞并将信号传递至胞内,引起T细胞的增殖活化从而通过释放穿孔素/颗粒酶靶向杀伤肿瘤细胞,且不受主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibilityComplex,MHC)的限制。近年来CAR-T治疗已应用于白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脑胶质瘤、黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、胰腺癌及卵巢癌等肿瘤。其中在血液系统恶性肿瘤中的研究取得的成绩最为瞩目。目前已开展针对如CD19、CD22、CD20、CD33、CD30、CD38、BCMA、CD138、CD123等靶点的CAR-T细胞临床治疗研究。其中最显著的疗效主要体现在B细胞来源恶性肿瘤性疾病中的应用,如急性B淋巴细胞白血病(B-ALL),慢性淋巴细胞白血病(CLL),多发性骨髓瘤(MM),B细胞淋巴瘤(B-NHL)等。国际上报道的靶向CD19的CAR-T(CART19)细胞治疗难治/复发B-ALL,完全缓解率(CR)达到90%。CAR-T细胞疗法在血液肿瘤治疗上的突破性进展给该研究领域带来了新的希望,尤其是传统治疗后无效或复发,在临床治疗决策者束手无策的情况下,CAR-T细胞免疫治疗成为最好的治疗选择。但在接受靶向CD19的CAR-T细胞治疗患者中,复发成了CAR-T细胞治疗的主要障碍,约30-50%的患者在接受CAR-T细胞治疗后复发,且复发大多发生在接受CAR-T细胞治疗1年内;而大多数实体瘤予靶向CAR-T细胞治疗疗效欠佳。目前认为靶向CD19的CAR-T细胞治疗后原发病复发主要的原因是CAR-T细胞在体内的丢失,也即不能在体内长期维持;证据显示,CAR-T细胞治疗后患者的长期无病生存与CAR-T细胞在体内的维持时间高度相关。而CAR-T细胞耗竭不仅是靶向CD19的CAR-T细胞治疗血液系统肿瘤性疾病后肿瘤复发的重要因素,同时也是治疗实体瘤疗效欠佳的重要原因。因此开发提高CAR-T细胞疗效,延长CAR-T细胞在体内维持的方法,对提高CAR-T细胞治疗肿瘤性疾病的疗效、防止疾病复发和提高患者长期无病生存率至关重要。CAR-T细胞在体内的疗效和持久性与其在体外培养过程中获得细胞制品的分化阶段和耗竭状态显著相关。体外培养过程中,因CAR-T细胞表面CAR分子的相互聚集而产生自发持续的活化信号,不仅可使CAR-T细胞向终末阶段分化,且可发生耗竭现象,尤其是使用CD28共刺激结构域的CAR-T细胞。CAR-T细胞的分化阶段分为:初始T细胞,干性中心记忆T细胞,中心记忆T细胞,效应记忆T细胞,效应T细胞。CAR-T细胞制品中初始T细胞和中心记忆T细胞显示出在体内的长期存活能力,而向终末阶段如效应记忆阶段和效应分化的CAR-T细胞在体内作用不能持久;同时耗竭CAR-T细胞持续表达高水平的抑制性受体如PD1、TIM3、LAG3,增殖能力低、低细胞因子释放能力减弱,易发生凋亡,严重限制了CAR-T在体内持久地发挥效应功能。但目前国内外并没有解决体外培养过程中CAR-T细胞的终末分化和耗竭倾向的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高嵌合抗原受体T细胞疗效和作用持久性的细胞培养方法,通过以下具体步骤实现:1.外周血单个核细胞制备取外周血标本,肝素抗凝,应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞。2.CD3(+)T细胞富集及T细胞激活使用anti-CD3/CD28磁珠,与外周血单个核细胞充分混匀并结合于CD3(+)T细胞后,予磁力架富集CD3(+)T细胞,并同时利用结合在磁珠表面的anti-CD3/CD28抗体激活CD3(+)T细胞。3.携带靶向CD19的CAR慢病毒转染T细胞将已制备好的携带靶向CD19的CAR的慢病毒按照MOI=10转染anti-CD3/CD28磁珠活化的CD3(+)T细胞。4.添加络氨酸激酶抑制剂达沙替尼扩大培养CAR-T细胞取培养3-5天的GFP+CAR-T细胞,流式检测CAR分子的表达,确认CAR-T细胞制备成功后,将CAR-T细胞分2组分别连续培养9天:分别使用添加与不添加络氨酸激酶抑制剂达沙替尼的培养液培养CAR-T细胞。分实验组和对照组2组,达沙替尼30nmol/L实验组(RPMI1640+10%FBS+IL-2200U/ml+达沙替尼30nM),对照组:等体积DMSO对照组(RPMI1640+10%FBS+IL-2200U/ml+等体积DMSO)。5.CAR-T细胞亚群检测培养第9天取样本标记荧光抗体CD45RO、CD62L,流式细胞仪检测CAR-T细胞亚群;经步骤(4)培养的CAR-T细胞,细胞分化能够持续保持在初始T细胞和中央记忆T细胞阶段,有效地抑制了CAR-T细胞向下游及终末阶段分化。6.CAR-T细胞耗竭相关表面分子的检测培养第9天取样本标记荧光抗体PD1、TIM3、LAG3,流式细胞仪检测CAR-T细胞耗竭相关表面分子;经步骤(4)培养的CAR-T细胞,低表达T细胞耗竭相关抑制性受体PD1、TIM3、LAG3,有效地抑制了CAR-T细胞的耗竭倾向。7.评估经达沙替尼处理的CAR-T细胞疗效及持久性准备ALL-NSG小鼠模型,按照以下分组:①对照组(尾静脉注射DMSO处理的CAR-T细胞),②实验组(尾静脉注射达沙替尼30nM培养的CAR-T细胞)进行试验;每周使用小动物活体成像仪给小鼠成像,比较两组肿瘤负荷差异;每周流式细胞术检测CAR-T细胞比例;记录各组小鼠死亡时间,绘制生存曲线。经步骤(4)培养的CAR-T细胞,治疗急性淋巴细胞白血病小鼠,可获得更好的疗效和生存期。本专利技术方法解决了体外培养过程中CAR-T细胞的终末分化和耗竭倾向的难题,通过添加络氨酸激酶抑制剂达沙替尼(dasatinib)减少CAR-T细胞活化信号传递,抑制了CAR-T细胞的终末分化,提高了CAR-T细胞制品中的初始T细胞和中心记忆T细胞的比例,同时抑制CAR-T细胞的耗竭倾向,获得了疗效更显著、体内维持时间更长的CAR-T细胞制品。本专利技术建立的方法解决了体外培养过程中CAR-T细胞的终末分化和耗竭倾向的难题,通过添加络氨酸激酶抑制剂达沙替尼减少CAR-T细胞活化信号传递,抑制了CAR-T细胞的终末分化,提高了CAR-T细胞制品中的初始T细胞和中心记忆T细胞的比例,同时抑制CAR-T细胞的耗竭倾向,获得了疗效更显著、体内维持时间更长的CAR-T细胞制品。专利技术方法具有以下特点:(1)培养过程简单易行,成本低廉,临床应用安全可靠;(2)培养得到的CAR-T细胞初始T细胞和中心记忆T细胞比例高,并避免了CAR本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种提高嵌合抗原受体T细胞疗效和作用持久性的细胞培养方法,其特征在于,通过以下步骤实现:(1)外周血单个核细胞制备:取外周血标本,肝素抗凝,应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞;(2)CD3(+)T细胞富集及T细胞激活:使用anti‑CD3/CD28磁珠,与外周血单个核细胞充分混匀并结合于CD3(+)T细胞后,予磁力架富集CD3(+)T细胞,并同时利用结合在磁珠表面的anti‑CD3/CD28抗体激活CD3(+)T细胞;(3)携带靶向CD19的CAR慢病毒转染T细胞:将已制备好的携带靶向CD19的CAR的慢病毒按照MOI=10转染anti‑CD3/CD28磁珠活化的CD3(+)T细胞;(4)添加络氨酸激酶抑制剂达沙替尼扩大培养CAR‑T细胞取培养3‑5天的CAR‑T细胞,流式检测CAR分子的表达,确认CAR‑T细胞制备成功后,将CAR‑T细胞分2组分别连续培养9天;(5)CAR‑T细胞亚群检测:培养第9天取样本标记荧光抗体CD45RO、CD62L,流式细胞仪检测CAR‑T细胞亚群;(6)CAR‑T细胞耗竭相关表面分子的检测培养第9天取样本标记荧光抗体PD1、TIM3、LAG3,流式细胞仪检测CAR‑T细胞耗竭相关表面分子;(7)评估经达沙替尼处理的CAR‑T细胞疗效及持久性分对照组和实验组,对照组用DMSO处理的CAR‑T细胞,实验组用达沙替尼30nM培养的CAR‑T细胞,通过成像仪比较两组肿瘤负荷差异,通过流式细胞术检测CAR‑T细胞比例,绘制生存曲线。...

【技术特征摘要】
1.一种提高嵌合抗原受体T细胞疗效和作用持久性的细胞培养方法,其特征在于,通过以下步骤实现:(1)外周血单个核细胞制备:取外周血标本,肝素抗凝,应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞;(2)CD3(+)T细胞富集及T细胞激活:使用anti-CD3/CD28磁珠,与外周血单个核细胞充分混匀并结合于CD3(+)T细胞后,予磁力架富集CD3(+)T细胞,并同时利用结合在磁珠表面的anti-CD3/CD28抗体激活CD3(+)T细胞;(3)携带靶向CD19的CAR慢病毒转染T细胞:将已制备好的携带靶向CD19的CAR的慢病毒按照MOI=10转染anti-CD3/CD28磁珠活化的CD3(+)T细胞;(4)添加络氨酸激酶抑制剂达沙替尼扩大培养CAR-T细胞取培养3-5天的CAR-T细胞,流式检测CAR分子的表达,确认CAR-T细胞制备成功后,将CAR-T细胞分2组分别连续培养9天;(5)CAR-T细胞亚群检测:培养第9天取样本标记荧光抗体CD45RO、CD62L,流式细胞仪检测CAR-T细胞亚群;(6)CAR-T细胞耗竭相关表面分子的检测培养第9天取样本标记荧光抗体PD...

【专利技术属性】
技术研发人员:黄河张浩徐玉林
申请(专利权)人:浙江大学
类型:发明
国别省市:浙江,33

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