一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物、探针、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物、探针、试剂盒和检测方法，属于生物安全技术领域。所述的RPA引物如下，RPA上游引物序列Vd‑RPA‑F如SEQ ID No.1所示，其下游引物序列Vd‑RPA‑R如SEQ ID No.2所示；所述的RPA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，其序列大小为49bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3‑Sp acer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端33bp处进行THF修饰。本发明专利技术还提供基于所述RPA引物和探针形成的试剂盒和检测方法。本发明专利技术首次将RPA技术应用到棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点，为棉花黄萎病的早期诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法。

A RPA Primer, Probe, Kit and Detection Method for Detecting Verticillium dahliae Caused by Verticillium Wilt in Cotton

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物、探针、试剂盒和检测方法
本专利技术属于生物安全
，具体地说，涉及一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物、探针、试剂盒和检测方法。
技术介绍
由大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)引起的棉花黄萎病属于土传性真菌病害，在世界各棉区普遍发生，是制约棉花生产最主要的病害之一。大丽轮枝菌主要以微菌核的形式在土壤中长期存活，可以在棉花的各生育时期入侵并发病。我国是棉花黄萎病发生危害最严重的地区，且发病程度呈明显上升趋势。因此，快速准确地检测出大丽轮枝菌，对棉花黄萎病的早期诊断、监测和预警以及综合防治具有及其重要的意义。近年来，分子生物学技术的不断发展，为大丽轮枝菌的快速检测提供了良好的技术平台。目前，常规分子检测技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR技术、微流控芯片PCR、限制性片段长度多态性(RFLP)、实时荧光定量PCR(qPCR)、环介导等温技术(LAMP)等。上述检测方法具有特异性强、灵敏度高及准确性高等优点，同时可以实现对发病组织和大批量土壤样品的定量检测，但是该技术对仪器设备、实验条件、人员专业素质要求较高。因此，继续开发对大丽轮枝菌高效、精确、对仪器设备要求低的检测技术具有重要的实践价值。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinasepolymeraseamplification，RPA)是新兴的恒温扩增技术，其在重组酶的介导下模拟DNA复制过程。重组酶与RPA引物结合形成蛋白-DNA复合物后，与模板DNA进行同源比对，在单链结合蛋白的作用下，模板DNA解链，引物与模板DNA结合。随后，在DNA聚合酶的作用下，进行扩增反应，整个过程在37℃-42℃恒温反应20min即可完成；同时结合侧向流动免疫层析技术，可在10min内完成RPA扩增产物的检测，即利用RPA技术可在30min内完成对大丽轮枝菌的可视化检测。目前，RPA技术已广泛应用于病毒、细菌、支原体和寄生虫的快速检测中，但尚未见其在棉花黄萎病病原大丽轮枝菌检测方面的报道。
技术实现思路
1、要解决的问题针对棉花黄萎病病原大丽轮枝菌尚无有效进行RPA技术检测的问题，本专利技术提供一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物、探针、试剂盒和检测方法，它可以提高棉花黄萎病病原大丽轮枝菌检测的特异性和灵敏度，为棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的现场检测和早期诊断提供新方法。2、技术方案为解决上述问题，本专利技术采用如下的技术方案。一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物和RPA探针，所述的RPA引物基于棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的ITS区差异序列设计，所述的RPA引物的上游引物Vd-PRA-F如SEQIDNo.1所示，所述的RPA引物的下游引物Vd-PRA-R如SEQIDNo.2所示；所述的RPA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，所述的RPA探针的序列大小为45bp-54bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的30bp-38bp处进行THF修饰。优选地，所述的RPA引物的下游引物包括如SEQIDNo.2所示的序列，且其5’端用Biotin修饰；所述的RPA探针Vd-LF-Probe如SEQIDNo.3所示的序列，其序列大小为49bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的33bp处进行THF修饰。一种含有上述所述的RPA引物和RPA探针的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的试剂盒。优选地，所述的试剂盒还包括RPA反应管、阴性对照模板、阳性对照模板中的至少一种。一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，包括以下步骤：(1)提取样品中的DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用上述所述的RPA引物和RPA探针，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；(3)分析RPA扩增产物。优选地，步骤(1)中所述的样品为棉田发病土壤。优选地，所述的RPA引物和RPA探针的检出下限为10pgDNA。优选地，步骤(2)中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：优选地，步骤(2)中RPA扩增反应的反应条件为：37℃-45℃(具体应用时，可以选择37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃)下反应20分钟，随后冰上终止反应。优选地，步骤(3)中分析RPA扩增产物的方法包括如下步骤：取RPA扩增产物与缓冲液混匀制备混合液，将试纸条上样区置于混合液中，4min-5min后观察并记录结果；结果的判定如下：若试纸条的检测线位置出现条带(即为检测带)，而且质控线位置出现条带(即为质控带)，则表明该样品中含有棉花黄萎病病原大丽轮枝菌，若试纸条仅质控线位置出现条带(即为质控带)，则表明该样品中不含有棉花黄萎病病原大丽轮枝菌。3、有益效果相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术RPA引物、探针、试剂盒及检测方法，首次将RPA技术应用到棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点；其中RPA引物和探针基于棉花黄萎病病原大丽轮枝菌ITS区差异序列设计，可稳定扩增且特异性较高，对大丽轮枝菌的检测准确率高；其中试剂盒和检测方法具有较高的检测灵敏度，可在38℃下和30min内完成对大丽轮枝菌DNA的恒温扩增和可视化检测，无需PCR仪、凝胶电泳和成像系统，极大提高检测效率，解决了现有常规检测手段所需时间较长、对仪器设备条件和实验人员素质要求高的现象。由此可见，本专利技术建立的棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA检测方法操作简单且结果易判定，为棉花黄萎病的早期诊断和指导科学施药提供有力技术支持。附图说明图1为实施例2棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA检测方法建立(正向引物Vd-RPA-F、反向引物Vd-RPA-R及探针Vd-LF-Probe)的检测结果图；图2为实施例2棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA检测方法建立(正向引物Vd-RPA-F2、反向引物Vd-RPA-R2及探针Vd-LF-Probe2)的检测结果图图3为实施例3棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA引物和探针(正向引物Vd-RPA-F、反向引物Vd-RPA-R及探针Vd-LF-Probe)的特异性检测结果图；图4为实施例3棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA引物和探针(正向引物Vd-RPA-F2、反向引物Vd-RPA-R2及探针Vd-LF-Probe2)的特异性检测结果图；图5为实施例4棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA引物和探针(正向引物Vd-RPA-F、反向引物Vd-RPA-R及探针Vd-LF-Probe)的灵敏度检测结果图；图6为实施例4棉花黄萎病病原大丽轮枝菌RPA引物和探针(正向引物Vd-RPA-F2、反向引物Vd-RPA-R2及探针Vd-LF-Probe2)的灵敏度检测结果图；图7为实施例5棉田土壤中棉花黄萎病病原大丽轮枝菌(正向引物Vd-RPA-F、反向引物Vd-RPA-R及探针Vd-LF-Probe)的检测结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。以下实施例中使用的RPA反应管以及反应缓冲液均购白英国TwistDX公司，商品编号TANFO02KIT；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物和RPA探针，其特征在于：所述的RPA引物基于棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的ITS区差异序列设计，所述的RPA引物的上游引物Vd‑PRA‑F如SEQ ID No.1所示，所述的RPA引物的下游引物Vd‑PRA‑R如SEQ ID No.2所示；所述的RPA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，所述的RPA探针的序列大小为45bp‑54bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3‑Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的30bp‑38bp处进行THF修饰。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物和RPA探针，其特征在于：所述的RPA引物基于棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的ITS区差异序列设计，所述的RPA引物的上游引物Vd-PRA-F如SEQIDNo.1所示，所述的RPA引物的下游引物Vd-PRA-R如SEQIDNo.2所示；所述的RPA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，所述的RPA探针的序列大小为45bp-54bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的30bp-38bp处进行THF修饰。2.根据权利要求1所述的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的RPA引物和RPA探针，其特征在于：所述的RPA引物的下游引物包括如SEQIDNo.2所示的序列，且其5’端用Biotin修饰；所述的RPA探针Vd-LF-Probe如SEQIDNo.3所示的序列，其序列大小为49bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的33bp处进行THF修饰。3.一种含有权利要求1或2所述的RPA引物和RPA探针的用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的试剂盒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括RPA反应管、阴性对照模板、阳性对照模板中的至少一种。5.一种用于检测棉花黄萎病病原大丽轮枝菌的检测方法，其特征在于：包括以下步...

【专利技术属性】
技术研发人员：李常凤，韩文兵，秦文强，闫晓明，周克海，宋云，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34