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一种普通油茶SSR分子标记引物及标记方法和应用技术

技术编号:21908469 阅读:22 留言:0更新日期:2019-08-21 10:47
本发明专利技术涉及分子标记技术领域,特别涉及一种普通油茶SSR分子标记引物及标记方法和应用,本发明专利技术通过对普通油茶根系进行RNA提取,测序和组装,利用MISA搜索SSR位点,并设计相应引物,以油茶基因组DNA为材料,对设计的SSR引物进行验证,从设计的6738对引物中得到相应的引物,该引物表现出多态性并可以成功区分不同品种来源的油茶材料;为油茶分子标记辅助育种提供新的分子标记,可为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的思路。

A SSR Molecular Marker Primer for Common Camellia oleifera and Its Marker Method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种普通油茶SSR分子标记引物及标记方法和应用
本专利技术涉及分子标记
,特别涉及一种普通油茶SSR分子标记引物及标记方法和应用。
技术介绍
普通油茶是油茶类物种中种植面积最广,总产量最高的木本油料植物,常用于榨取高质量的食用茶油;此外,榨油剩余物可进一步加工,用作化工、纺织和农药等行业的原材料。由于其不饱和脂肪酸含量高达90%以上,茶油是一种优质食用油,已被联合国粮农组织作为健康型高级食用油进行重点推广。随着生活水平的提高,人民对食用油的要求也随之提高。茶油变得供不应求,难以满足人民的需求。增加茶油的产量的关键是提高油茶的产量。油茶数量虽多,然而低产林占绝大多数,因此,培育普通油茶高产新品种十分紧迫。分子育种技术相对于常规育种周期短,准确度高等优点。然分子育种需要大量的优质分子标记。SSR就是其中之一。虽然目前已有关于利用油茶叶片,芽,花和种子等转录组开发了大量的SSR标记,但这些SSR分子标记是叶,芽,花和种子性状相关基因的功能标记。而还尚未有关于普通油茶根的转录组及SSR标记的开发,油茶根生长发育快,细胞分裂快,开展了普通油茶根发育转录组测序和SSR分子标记的开发和转移,将能为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的思路。
技术实现思路
鉴于上述内容,有必要提供一种普通油茶根的转录组及SSR标记的开发方法,该方法能为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的思路。为达到上述目的,本专利技术所采用的技术方案是:一种普通油茶SSR分子标记引物,所述SSR引物的序列如SEQIDNO.1~90所示。进一步的,所述SSR引物的序列如SEQIDNO.1~12、SEQIDNO.19~24、SEQIDNO.27~28、SEQIDNO.31~32、SEQIDNO.39~40、SEQIDNO.43~44、SEQIDNO.47~56、SEQIDNO.59~60、SEQIDNO.63~64、SEQIDNO.69~80、SEQIDNO.83~86、SEQIDNO.89~90所示。本专利技术还提供了一种应用所述SSR分子标记引物进行分子标记的方法,该方法包括如下步骤:(1)样品油茶根RNA提取:以组织培养过程中的油茶生根过程的油茶根部为材料,利用RNA提取试剂盒提取RNA,构建cDNA文库、测序;(2)设计样品油茶的SSR引物:利用FastQC对步骤(1)测序出的RNA数据进行质量控制,构建油茶根的Unigene序列;利用MISA对Unigene进行SSR位点检索,获得并设计一系列SSR位点的引物;(3)从步骤(2)的SSR引物中选择SSR引物用于对油茶样品进行分子标记;(4)转移的样品油茶DNA提取:取不同品种的油茶样品嫩叶存于-20°冰箱中,用改良的CTAB法提取其基因组DNA,存于-20℃待用;(5)SSR引物扩增:根据步骤(3)筛选的SSR引物,针对步骤(4)的样品油茶基因组DNA进行PCR扩增;反应结束后,在PCR管中加入6×Loadingbuffer2μL,混合均匀,吸取2μL在8.0%聚丙烯酰胺凝胶上200V电压下电泳1.5h,再进行快速银染,显影,照相;(6)油茶SSR引物遗传多样性分析:统计在普通油茶中无扩增产物、无多态和有多态三种情况的数量;进一步分析有扩增产物引物在不同油茶物种的转移情况;利用GenAlEx6.5估算多个油茶品种的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Shannon信息指数(I)。进一步的,所述步骤(1)(2)的样品油茶为:岑软3号。进一步的,所述步骤(4)转移的样品油茶为:金花茶3小叶、大叶金2、博白大果油茶、日本红山茶、小果油茶、南荣油茶、普通油茶、长林23号、长林4号、香花油茶、义安-2、宛田红花油茶、弄章实生、弄章01、官山01、鸿鸪01、那荡06、陆川大果油茶、鸿鸪08、鸿鸪23。进一步的,所述步骤(5)的PCR扩增体系为:用ddH2O补至总体积10μL;PCR反应程序为:预变性94℃4min;变性94℃30sec,退火59℃30sec(Δ℃=1℃),延伸72℃45sec,9个循环;变性94℃30sec,退火55℃30sec,延伸72℃30sec,21个循环,72℃延伸10min,4℃保存。本专利技术还提供一种所述的普通油茶SSR分子标记引物的应用,该引物用于检测不同油茶品种遗传多样性。本专利技术具有如下有益效果:本专利技术以油茶根系为材料,提取油茶根系的RNA并进行逆转录、测序、分析得到相应的SSR引物,油茶根生长发育快,细胞分裂快,对油茶根发育转录组测序和SSR分子标记的开发和转移,将能为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的引物和思路。【附图说明】图1是本专利技术实施例油茶生根过程转录组中SSR基序类型分布图;图2是本专利技术实施例SSR重复单元占比最多基序的百分比图。【具体实施方式】为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进,因此本专利技术不受下面公开的具体实施的限制。实施例:一、实验方法:1、样品油茶RNA提取方法:1)转录组测序实验材料:实验油茶品种为由普通油茶良种“岑软3号”。2)样本处理:以组织培养过程中“岑软3号”生根过程中的三个关键时间节点:插生根前为(CK组)、插生根后1天(T1组)、插生根后14天即[出现根点](T2组)、插生根后50天[根生长阶段](T3组),取得根部材料后,利用ddH2O冲洗干净琼脂糖后,立刻放入液氮中,待提取RNA。3)提取测序方法:利用RNAisoforpolysaccharide-richPlantTissue提取所有样本的RNA,并将CK,T1,T2和T3等量混合,构建cDNA文库,用于IlluminaHiSeq2000测序。2、SSR标记转移的实验材料及提取方法:1)SSR标记转移的实验材料为如下18个品种:金花茶3小叶、大叶金2、博白大果油茶、日本红山茶、小果油茶、南荣油茶、普通油茶、长林23号、长林4号、香花油茶、义安-2、宛田红花油茶、弄章实生、弄章01、官山01、鸿鸪01、那荡06、陆川大果油茶、鸿鸪08、鸿鸪23。2)SSR标记应用材料:取上述18个品种的嫩叶,利用改良的CTAB法提取其基因组DNA,存于-20℃待用。3、数据分析:利用FastQC对转录组数据进行质量控制,利用Trimmomatic过滤低质量序列,接头等得到CleanData.再利用Trinity对cleandata进行组装,得到转录组组装结果。在此基础上,利用MISA搜索SSR位点,并设计相应的SSR位点引物。对转录组SSR标记进行特征分析,并分别从转录组开发的SSR中随机选择45对SSR标记引物(引物序列如表1所示),用于下一步的验证和应用。表1普通油茶根转录组开发合成用于本实验的SSR引物4、SSR引物扩增:根据步骤表1筛选的SSR引物,针对步骤3的18个样品油茶基因组DNA进行PCR扩增PCR反应体系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种普通油茶SSR分子标记引物,其特征在于,所述SSR引物的序列如SEQ ID NO.1~90所示。

【技术特征摘要】
1.一种普通油茶SSR分子标记引物,其特征在于,所述SSR引物的序列如SEQIDNO.1~90所示。2.根据权利要求1所述的普通油茶SSR分子标记引物,其特征在于,所述SSR引物的序列如SEQIDNO.1~12、SEQIDNO.19~24、SEQIDNO.27~28、SEQIDNO.31~32、SEQIDNO.39~40、SEQIDNO.43~44、SEQIDNO.47~56、SEQIDNO.59~60、SEQIDNO.63~64、SEQIDNO.69~80、SEQIDNO.83~86、SEQIDNO.89~90所示。3.一种应用权利要求1所述SSR分子标记引物进行分子标记的方法,其特征在于:所述方法包括如下步骤:(1)样品油茶根RNA提取:以组织培养过程中的油茶生根过程的油茶根部为材料,利用RNA提取试剂盒提取RNA,构建cDNA文库、测序;(2)设计样品油茶的SSR引物:利用FastQC对步骤(1)测序出的RNA数据进行质量控制,构建油茶根的Unigene序列;利用MISA对Unigene进行SSR位点检索,获得并设计一系列SSR位点的引物;(3)从步骤(2)的SSR引物中选择SSR引物用于对油茶样品进行分子标记;(4)转移的样品油茶DNA提取:取不同品种的油茶样品嫩叶存于-20°冰箱中,用改良的CTAB法提取其基因组DNA,存于-20℃待用;(5)SSR引物扩增:根据步骤(3)筛选的SSR引物,针对步骤(4)的样品油茶基因组DNA进行PCR扩增;反应结束后,在PCR管中加入6×Loadingbuffer2...

【专利技术属性】
技术研发人员:王鹏良杨利平王华宇
申请(专利权)人:钦州学院
类型:发明
国别省市:广西,45

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