一种鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法及应用，该方法包括利用特异性引物对红铃虫卵DNA进行PCR扩增，通过检测是否得到预期的扩增产物，判断红铃虫卵是否被甲腹茧蜂寄生，所述的特异性引物包括PG‑PL10‑F2(如SEQ ID NO:1所示)和PG‑PL10‑R2‑1(如SEQ ID NO:2所示)、PG‑PL10‑R2‑2(如SEQ ID NO:3所示)。本发明专利技术可从田间红铃虫卵快速、准确地检测出甲腹茧蜂是否寄生。

A Molecular Detection Method for the Identification of the Parasitism of Helicoverpa armigera by Cocoon Bee

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法及应用
本专利技术属于分子生物学
，具体而言，涉及一种特异性引物及鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法及应用。
技术介绍
红铃虫甲腹茧蜂Chelonuspectinophorae(Cushman)为一种跨卵-幼虫期寄生蜂，其寄主除了红铃虫Pectinophoragassypiella(Saunders)，还包括鼎点金刚钻Eariascupreoviridis(Walker)、甘蔗小卷蛾Argyroploceschistaceana(Snellen)、棉大卷叶螟Syleptaderogata(Fabricius)、大豆食心虫Leguminivoraglycinivorella(Matsumura)等大量鳞翅目害虫，是一种非常具有潜力的天敌昆虫。该寄生蜂在我国湖北、安徽、河南、四川、江苏、浙江、江西及台湾等地区均有分布。在寄生蜂人工繁殖中，寄生率和孵化率是十分重要的指标，常常被用以评价该寄生蜂商品价值的高低。通常，会采用该寄生蜂后代的啮出数量、结茧或出蜂数量作为其产卵能力的评判依据。但和大多卵寄生蜂一样，红铃虫甲腹茧蜂对中间寄主红铃虫进行产卵后，其孵化的幼虫还需继续在中间寄主红铃虫体内进行取食，发育到一定阶段才从红铃虫寄主体内啮出，继而化茧。在这一系列生长发育过程中，甲腹茧蜂后代生长进程受中间寄主所在的环境温度、湿度、光照及食物等条件影响较大。因此，选用寄生蜂啮出率、化茧率及出蜂率作为卵寄生蜂红铃虫甲腹茧蜂寄生能力的评判依据，在一定程度上并不能真正反映其真实的控害能力。为了评价红铃虫甲腹茧蜂对红铃虫的控害潜能，选择一种操作简便、科学有效的分子检测技术用于鉴定卵寄生蜂对寄主的寄生能力则显得必要和实用。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种特异性引物，以及提供一种快速鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法及应用。为了实现本专利技术的目的，专利技术人首次提出针对甲腹茧蜂DEAD-box家族PL10基因，设计了特异性引物PG-PL10-F2和PG-PL10-R2-1、PG-PL10-R2-2，对不同处理的红铃虫卵DNA样本进行扩增检测，发现只有在被甲腹茧蜂寄生处理过的红铃虫DNA样本中才能扩增出PL10基因的目的条带。具体地，本专利技术的技术方案概括如下：两对特异性引物，所述的特异性引物包括PG-PL10-F2和PG-PL10-R2-1、PG-PL10-R2-，其中PG-PL10-F2的序列如SEQIDNO:1所示，PG-PL10-R2-1的序列如SEQIDNO:2所示，PG-PL10-R2-3的序列如SEQIDNO:3所示。从本专利技术的研究结果来看，利用上述特异性引物扩增PL10基因，可实现对红铃虫甲腹茧蜂进行种类鉴定，进而用来判别田间红铃虫卵被甲腹茧蜂寄生情况。在统计卵寄生蜂寄生率方面，避免了卵寄生蜂后代受寄主自身条件、食物等条件影响，导致统计出蜂情况与寄生率不符的情况发生。因此进一步地，本专利技术还提供了上述的特异性引物在检测红铃虫是否被甲腹茧蜂寄生或/和甲腹茧蜂的产卵量中的应用。另外，本专利技术还提供了一种鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法，该方法包括利用上述的特异性引物对红铃虫卵DNA进行PCR扩增，通过检测是否得到扩增产物，判断红铃虫卵是否被甲腹茧蜂寄生。进一步优选地，如上所述鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法，其具体包括如下步骤：(1)提取红铃虫卵组织中全部DNA；(2)以步骤(1)所得DNA为模板，利用上述的特异性引物，进行PCR扩增反应；(3)取PCR反应扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳检测；(4)根据电泳条带中是否出现甲腹茧蜂PL10基因片段的特征条带，判断红铃虫卵是否被甲腹茧蜂寄生。在本专利技术最优选的实施方式中，如上所述鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法，其特征在于，所述PCR反应的反应条件为：95℃，预变性5min；95℃，变性30s；分别在60℃下，退火30s；72℃，延伸30s；循环35个，72℃延伸10min。在本专利技术最优选的实施方式中，如上所述鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法，其特征在于，所述PCR反应的反应体系：10×Extaqbuffer2.5μL，2.5mMdNTPs2μL，Extaq酶0.125μL，正反引物各1μL，DNA1.5μL或cDNA1.5μL，补充ddH2O至25μL。由于利用上述特异性引物可实现判别田间红铃虫卵被甲腹茧蜂寄生情况，因此本专利技术还提供了一种鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的试剂盒，该试剂盒含有上述的特异性引物。进一步优选地，如上所述鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的试剂盒，其还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和显著的进步：(1)本专利技术基于甲腹茧蜂和红铃虫的PL10片段序列差异，设计出可快速、准确检测甲腹茧蜂寄生的特异性引物，并在此基础上建立了PCR检测体系，可从田间红铃虫卵快速、准确地检测出甲腹茧蜂是否寄生。(2)本专利技术首次提出利用甲腹茧蜂PL10基因的DNA条形编码对红铃虫甲腹茧蜂进行种类鉴定，进而用来判别田间红铃虫卵被甲腹茧蜂寄生情况。(3)本专利技术在统计卵寄生蜂寄生率方面，避免了卵寄生蜂后代受寄主自身条件、食物等条件影响，导致统计出蜂情况与寄生率不符的情况发生，有利于实现快速准确统计寄生蜂寄生田间红铃虫卵的寄生率。这种检测方法具有方便、快捷、经济、准确等优点。附图说明图1：兼并引物Pg-V-F、Pg-V-R1对甲腹茧蜂模板扩增情况；其中M：Marker(DL2000),1-3：甲腹茧蜂DNA，4-6：甲腹茧蜂cDNA,7-8：空白对照。图2：兼并引物Pg-V-F、Pg-V-R2对甲腹茧蜂模板扩增情况；其中M：Marker(DL2000),1-3：甲腹茧蜂DNA，4-6：甲腹茧蜂cDNA,7-8：空白对照。图3：兼并引物对红铃虫模板扩增情况；其中M：Marker(DL2000)，1-7为利用兼并引物Pg-V-F、Pg-V-R1的扩增情况(1-3：红铃虫DNA，4-6：红铃虫cDNA,7：空白对照)，8-14为利用兼并引物Pg-V-F、Pg-V-R2的扩增情况(1-3：红铃虫DNA，4-6：红铃虫cDNA,7：空白对照)；图4：甲腹茧蜂PL10基因扩增特异性引物筛选情况；其中M：Marker(DL2000),1--6：PG-PL10-F1和PG-PL10-R1-1(1-3为甲腹茧蜂，4--6为红铃虫，三个孔依次为52℃、55℃、58℃下产物，下同)；7--12：PG-PL10-F1和PG-PL10-R1-2(7-9为甲腹茧蜂，10--12为红铃虫)；13--18：PG-PL10-F2和PG-PL10-R2-1(13-15为甲腹茧蜂，16--18为红铃虫)19--24：PG-PL10-F2和PG-PL10-R2-2(19-21为甲腹茧蜂，22--24为红铃虫)。图5：对甲腹茧蜂寄生处理的红铃虫卵进行检测(红铃虫卵Action基因扩增情况)；其中M：Marker(DL2000),1-4：甲腹茧蜂寄生的单头红铃虫卵，5-8：甲腹茧蜂未寄生的单头红铃虫卵，9：空白对照。图6：特异性引物PG-PL10-F2和PG-P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物包括PG‑PL10‑F2和PG‑PL10‑R2‑1、PG‑PL10‑R2‑2，其中PG‑PL10‑F2的序列如SEQ ID NO:1所示，PG‑PL10‑R2‑1的序列如SEQ ID NO:2所示，PL10‑R2‑2的序列如SEQ ID NO:3所示。

【技术特征摘要】
1.一种特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物包括PG-PL10-F2和PG-PL10-R2-1、PG-PL10-R2-2，其中PG-PL10-F2的序列如SEQIDNO:1所示，PG-PL10-R2-1的序列如SEQIDNO:2所示，PL10-R2-2的序列如SEQIDNO:3所示。2.权利要求1所述的特异性引物在检测红铃虫卵是否被甲腹茧蜂寄生或/和甲腹茧蜂的产卵量中的应用。3.一种鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法，其特征在于，该方法包括利用权利要求1所述的特异性引物对红铃虫卵DNA进行PCR扩增，通过检测是否得到扩增产物，判断红铃虫卵是否被甲腹茧蜂寄生。4.根据权利要求3所述鉴定甲腹茧蜂对红铃虫寄生情况的分子检测方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：(1)提取红铃虫卵组织中全部DNA；(2)以步骤(1)所得DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物，进行PCR扩增反应；(3)取PCR反应扩增产物，通过琼脂糖凝胶电泳检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：许冬，王玲，丛胜波，李文静，杨妮娜，王金涛，尹海辰，万鹏，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院植保土肥研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42